肝癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-09-15; 12(9): 2045-2048
在线出版日期: 2004-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i9.2045
短发夹RNA抑制外源荧光素酶在肝癌细胞中的表达
胡礼仪, 张有顺, 周新, 戴宗晴, 黄玲, 王菊
胡礼仪, 张有顺, 戴宗晴, 黄玲, 王菊, 郧阳医学院附属东风医院肝脏外科研究所 湖北省十堰市 442008
周新, 武汉大学中南医院检验科 湖北省武汉市 430071
胡礼仪, 男, 1972-09-19生, 四川省筠连县人, 汉族, 1998年重庆医科大学本科毕业, 2002年武汉大学医学院临床检验诊断学专业硕士研究生, 主管技师, 研究方向为肿瘤的基因治疗.
基金项目: 湖北省卫生厅资助项目, No. JX1B116.
通讯作者: 张有顺, 442008, 湖北省十堰市大岭路10号, 郧阳医学院附属东风医院肝脏外科研究所. zlib125@163.com
电话: 0719-8272283
收稿日期: 2004-06-08
修回日期: 2004-06-12
接受日期: 2004-06-17
在线出版日期: 2004-09-15

目的: 构建含荧光素酶(luciferase, luc)基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达质粒, 并观察其在肝癌细胞Bel-7402中抑制外源荧光素酶的表达.

方法: 设计的两条反向重复的多聚核苷酸序列, 退火形成双链DNA, 再与双酶切后的载体PGE-1连接, 构建pshRNA-luc重组质粒, 与荧光素酶基因表达质粒pCMV-luc共转染肝癌细胞株BEL-7402, 检测其对荧光素酶表达的影响.

结果: PCR和DNA序列分析证实了重组质粒构建成功. pshRNA-luc对共转染的pCMV-luc中的荧光素酶具有明显的抑制作用, 抑制率可达86%(P <0.01).

结论: 构建的pshRNA-luc表达质粒能有效地抑制荧光素酶在肝癌细胞中的表达, 为RNA干扰用于肿瘤的基因治疗打下基础.

关键词: N/A
引文著录: 胡礼仪, 张有顺, 周新, 戴宗晴, 黄玲, 王菊. 短发夹RNA抑制外源荧光素酶在肝癌细胞中的表达. 世界华人消化杂志 2004; 12(9): 2045-2048
Inhibition of luciferase expression in hepatocellular carcinoma cells by short hairpin RNA
Li-Yi Hu, You-Shun Zhang, Xin Zhou, Zong-Qing Dai, Lin Huang, Ju Wang
Li-Yi Hu, You-Shun Zhang, Zong-Qing Dai, Lin Huang, Ju Wang, Hepatosurgery Institute, Dongfeng Hospital of Yunyang Medical College, Shiyan 442008, Hubei Province, China.
Xin Zhou, Department of Laboratory Science, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China.
Supported by: Hubei Public Health Foundation, No. JX1B116.
Correspondence to: Dr You-Shun Zhang, Hepatosurgery Institute, Dongfeng Hospital of Yunyang Medical College, Shiyan 442008, Hubei Province, China. zlib125@163.com
Received: June 8, 2004
Revised: June 12, 2004
Accepted: June 17, 2004
Published online: September 15, 2004

AIM: To construct a recombinant plasmid containing short hairpin RNA of luciferase in order to suppress the expression of luciferase gene in hepatocellular carcinoma cells line Bel-7402.

METHODS: Two inverted repeating oligonucleotides, double-stranded DNA which dropped temperature were designed, and then cloned into PGE-1 vector digesting by the double restricted endoenzymes to generate the plasmids pshRNA-luc, pshRNA-luc and pCMV-luc, which were cotransfected into hepatocellular carcinoma cells line Bel-7402 to detect effect of luciferase expression.

RESULTS: The size of the PCR product was 652 bp. DNA sequencing showed the sequence of recombinant plasmids pshRNA-luc was successfully constructed. The recombinant plasmids suppressed the expression of luciferase gene by 86% in Bel-7402 cells (P <0.01).

CONCLUSION: Short hairpin RNA of luciferase can efficiently suppress its expression in hepatocellular carcinoma cells Bel-7402.

Key Words: N/A
0 引言

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年发展起来的一种研究基因功能的新方法, 他通过将双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 导入细胞后, 在Dicer酶的作用下产生有活性的干扰性RNA(small interfering RNA, siRNA), 与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解, 从而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象[1-4]. 他具有高效性, 高特异性, 快速性等特点. 《Science》杂志将这一新发现评为2002年世界十大科学成就之首.RNA干扰在基因功能研究、抗肿瘤和抗病毒基因治疗等方面均得到了广泛应用[5-11]. 我们采取基因沉默策略, 利用带U6启动子的PGE-1载体, 构建在细胞内产生短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)的重组质粒, 并研究其在肝癌细胞中对外源性荧光素酶基因的抑制作用, 进而为应用RNA干扰技术来抑制外源基因的表达研究奠定基础.

1 材料和方法
1.1 材料

SCS1大肠埃希氏菌菌株和表达质粒pGE-1、pCMV-luc购自 Stratagene 公司; TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、AMV逆转录酶、质粒提取试剂、MgCl2、荧光素酶检测试剂盒均购自Promega公司; 限制性内切酶B am H I和X ba I购自MBI公司; Trizol试剂盒、 RPMI1640培养基、胎牛血清、低熔点琼脂糖购自Gibco公司; 转染试剂LyoVecTM为InvivoGen公司产品;DNA片段由上海生工生物工程有限公司合成. 人肝癌细胞株Bel-7402为华中科技大学同济医学院免疫教研室沈关心教授惠赠, 常规培养于含100 mL/L胎牛血清, 青、链霉素各100 mg/L于RPMI 1640培养基中, 培养条件为37 ℃、50 mL/L CO2. 待80%的细胞贴壁后备用.

1.2 方法

1.2.1 多聚核苷酸序列的设计及质粒的构建: 根据Luciferase mRNA选择目标序列, 按照shRNA的设计原则[12-13], 设计合成两条含Luciferase的反向重复序列, 并利用BLAST进行同源搜索, 确定其为特异性序列. 正义、反义序列分别为CGC GCT TGG TAG AGG TGG A和TCC ACC TCT ACC AAG CGC G. 正义链与反义链之间插入8 nt的回折序列GAAGCTTG; 在之后连接上6个"T", 此为RNA聚合酶Ⅲ的终止子, 另外在反向重复序列的两端分别保留Bam H I或X ba I的酶切位点. 将设计并合成好的多聚核苷酸, 各取1 mL, 另外加dH2O4 3 mL, 10×退火缓冲液5 mL, 93 ℃热冲击3 min, 然后在至少30 min内自然冷却至37 ℃, 即获得含Luciferase的退火双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)分子.然后将带U6启动子的PGE-1质粒进行扩增及提取后经电泳、紫外分光光度仪检测(A260/A280), 鉴定所提质粒的大小、纯度及含量.然后用限制性内切酶Bam H I和Xba I进行消化, 低熔点琼脂糖凝胶电泳法分离回收酶切片段, 再用苯酚、氯仿各抽提一次, 无水乙醇沉淀DNA. 酶切线性质粒和插入片段的连接条件: PGE-1线性载体1 mL, dsDNA 3 mL, rATP 1 mL, 10×Ligase buffer 1 mL, T4DNAligase 1 mL, ddH2O3 mL, 4 ℃过夜, 连接产物命名为pshRNA-luc.

1.2.2 重组质粒鉴定: 取阳性质粒菌株和重组质粒菌株做PCR, 引物序列为上游5'- CGT CGA TTT TTG TGA TGC TCG TCAG-3', 下游3'-GAA GCA TTT ATC AGG GTT ATT GTC TCA TG-5', PGE-1扩增产物的分子大小为605 bp, pshRNA-luc为652 bp. PCR反应体系如下: 10×缓冲液4.0 mL, dNTP(25 mmol/L) 0.4 mL, 上、下游引物各取0.8 mL (10 mmol/L), Tween20(100 g/L)4 mL, DMSO 2.8 mL, TaqDNA酶2.0 U, 总体积40 mL, 挑取质粒菌株加入PCR反应管中, 其扩增条件为: 94 ℃变性3 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环后, 72 ℃延伸5 min. 取PCR产物和DNA Marker经50 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染观察并拍照.另外将PCR产物送上海博亚生物技术有限公司进行序列分析, 进一步证实DNA片段已克隆入载体中.

1.2.3 细胞转染及荧光素酶基因表达的检测: Bel-7402细胞1×105接种于6孔板, 37 ℃、50 mL/L CO2培养, 待80%细胞贴壁后, 换入无血清的RPMI 1640培养基800 mL, 同时分别加入AB混合液200 mL (A液:一定量的质粒稀释于100 mL无血清RPMI1640中; B液: 25 mL脂质体稀释于100 mL无血清RPMI 1640中, 混合AB液, 置室温孵育30 min), 培养5 h后加入小牛血清终止转染, 24 h后换完全培养基, 然后培养不同时间备用.实验设pCMV-luc单独转染组和pCMV-luc、pshRNA-luc共转染组以及pCMV-luc、pGE-1-neg共转染组, 实验重复3次. 质粒转染细胞培养24-72 h观察(仅48 h照相), 细胞单层直接在荧光显微镜下观察荧光素酶在细胞内表达的变化, 并拍照. 另外在转染细胞培养48 h后, 采用荧光素酶检测试剂盒, 按照其推荐的步骤进行操作, 用荧光素酶测试仪进行手动测值. 每个样本重复3次, 取平均值.

统计学处理 数据采用mean±SD表示, 用SPSS10.0统计软件进行t检验, 以P <0.05具有统计学差异.

2 结果
2.1 shRNA表达质粒的构建

pshRNA-luc重组质粒的构建过程以及其在细胞内从DNA模板产生shRNA的策略(见图1).

图1
图1 pshRNA-luc重组质粒的构建过程及体内由DNA模板产生shRNA的策略.
2.2 PCR产物电泳分析

将阳性质粒菌株和重组质粒菌株分别做PCR, 取PCR产物0.5 mL用于50 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染结果显示, 在分子大小605 bp和652 bp处分别有一条清楚的带, 与预计的相符(图2). 另外DNA测序结果进一步证实了序列已克隆入载体中.

图2
图2 质粒PCR扩增产物聚丙烯酰胺电泳图. M: Marker; 1、2: 为pshRNA-luc扩增产物; 3、4: 为PGE-1扩增产物.
2.3 荧光素酶的表达水平

荧光显微镜观察pshRNA-luc和pCMV-luc共转染后肝癌细胞内荧光的表达明显比单独转染组减少(图3).取细胞裂解液2 mL测定荧光素酶活性, pshRNA-luc共转染组比单独转染组降低了86%, P <0.01, 而阴性质粒组与单独转染组差异很小(图4).

图3
图3 荧光显微镜观察luciferase在肝癌细胞中的表达变化. A: pCMV-luc转染组; B: pshRNA-luc和pCMV-luc共转染组.
图4
图4 荧光素酶活性检测结果.
3 讨论

自1998年Fire et al[14]首次提出RNA干扰的概念以来, 他很快就成为分子生物学领域研究的主要技术手段之一, 在人类基因功能研究、信号转导及基因治疗方面已显现出了巨大的前景.目前利用RNAi 对乙型肝炎[15-16]、丙型肝炎[17]、白血病[18]、艾滋病[19]的研究已取得了一定进展, 成功地下调了相关基因的表达.研究表明, siRNA具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点, 正逐渐取代反义核酸, 成为新的研究热点[20].诱导哺乳动物细胞RNAi的关键在于如何有效合成短干扰RNA, 目前siRNA来源有: (1)化学合成, (2)体外转录, (3)利用载体导入相应的发夹结构基因, 然后在启动子(主要为H1多聚酶Ⅲ和U6启动子)的作用下转录出shRNA, 进而直接在细胞内诱导RNAi. 虽然均有成功试验的报道[21-23], 但由于化学合成和体外转录费用较高, 转染效率低, 抑制作用短暂, 且需要多次重复导入等缺点, 因此限制了其应用和推广. 我们所构建的质粒产生shRNA的方法所产生的shRNA体内抑制目的基因的效果与合成siRNA相似, 但花费小、成本低, 可在细胞内稳定产生shRNA, 且在转染时还可克服合成siRNA可能造成的RNase污染[24].

由于荧光素酶作报告基因具有灵敏度高、易检测等特点, 所以他广泛应用于分子生物学研究中[25-26]. 我们构建了在细胞内产生荧光素酶shRNA的重组质粒, 并探讨其对所转染的报告基因荧光素酶表达水平的影响.结果表明: 转染pshRNA-luc后能有效并特异地抑制了外源荧光素酶在肝癌细胞中的表达, 其抑制率达80%以上(P <0.01), 与Ma et al[27]的研究结果相似. 我们的实验结果明确地显示, 在肝癌细胞中U6启动子转录短发状RNA介导的RNA干扰可以显著地降低相应序列基因的表达, 而且这种抑制是特异的, 说明我们的发夹样结构设计合理, 通过PGE-1载体构建对靶基因表达的shRNA重组质粒, 导入肿瘤细胞后, 在细胞内直接诱导RNAi的方法可行[28]. 这为在肝癌细胞系中利用RNAi来研究目的基因的功能奠定了基础, 也为利用导入含外源基因的短发夹RNA来进行肿瘤基因治疗提供理论依据. RNAi用于肿瘤的研究才刚刚开始, 但是已经显示出了巨大的潜力, 将成为肿瘤基因治疗的新希望[29-31].

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