慢性乙肝与HBV阳性肝癌患者树突状细胞表型和功能检测

摘要

目的: 探讨慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC的表型和功能及其与免疫耐受的关系.

方法: 选择慢性HBV感染者25例、HBV阳性肝癌患者11例及正常人15名, 从外周血中分离单个核细胞, 用细胞贴壁法富集DC, 流式细胞术测定DC HLAⅡ和共刺激分子的表达, 同位素掺入法测定DC的抗原提呈能力, ELISA方法测定抗原提呈过程中Th1和Th2类细胞因子的水平.

结果: 慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者HLAⅡ和共刺激分子的表达水平、抗原提呈能力和Th1类细胞因子的水平均低于正常(P<0.05)其中肝癌患者尤为明显, 而Th2类细胞因子的水平与正常相似(P>0.05).

结论: 慢性HBV感染与HBV阳性肝癌患者免疫耐受与DC的缺陷有关.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: July 23, 2004
Revised: July 24, 2004
Accepted: July 25, 2004
Published online: August 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)是一种非细胞病变病毒, 但可诱发慢性肝炎、肝硬化和肝癌. 病毒和宿主的免疫反应在慢性HBV感染和肝癌发生的过程中起关键作用. 树突状细胞(dendritic cells, DC)是最有效的专职性抗原提呈细胞, 能激活静止T淋巴细胞, 诱导一系列免疫反应, 清除病原体[1]. 用HBV转基因小鼠研究发现, 虽然淋巴细胞的功能相似, 但DC的功能却明显低于正常[2]. 提示慢性HBV感染及肝癌的发生可能与DC有关, 我们探讨慢性HBV感染者和HBV阳性肝癌患者DC的表型和抗原提呈能力, 以阐明慢性HBV感染及肝癌发生的机制.

1 材料和方法

1.1 材料

按照中华医学会修订的"病毒性肝炎防治方案", 选择慢性HBV感染者25例, 男18例, 女7例, 年龄20-47(平均29.3±6.0岁); HBV阳性肝癌患者11例, 男8例, 女3例, 年龄29-57(平均39.3±9.5岁); 另选健康志愿者15名, 男9名, 女6名, 年龄19-39(平均29.2±6.7岁). 1 mo内未接受免疫调节剂及核苷类抗病毒药治疗. 淋巴细胞分离液由中国医学科学院天津血液所生产, RPMI1640和AIM-V培养基购自Gibco Co, GM-CSF,IL-4, TNFα, IL-2, FITC标记的HLA-DR和CD1α, PE标记的CD80和CD86单抗及其对照, IFNγ, IL-10和IL-12检测试剂盒均购自深圳晶美生物工程公司, PHA、丝裂霉素C购自Sigma Co, 基因工程HBsAg由华北制药集团有限公司提供, 尼龙毛购自上海化纤九厂, ³H-TdR购自法国NEN DuPont公司. FACS Calibar流式细胞仪由美国Beckton Dickson公司生产, 液闪仪由美国Backman公司生产, IMx全自动定量免疫分析系统由美国雅培制药有限公司生产, 其余均为国产仪器.

1.2 方法

各指标检测严格按说明书要求操作.

统计学处理 计量资料以(mean±SD)表示, 组间比较用t检验, P<0.05, 则可认为组间的差别具有统计学意义.

2 结果

2.1 DC表型

慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC表面HLA-DR, CD83和CD86的表达水平较正常低, 且后者尤甚(P<0.05, 表1)而CD1α的表达与正常无明显不同(P>0.05), 提示其HLAⅡ和共刺激分子的表达水平较低, 处于不成熟状态, 可能影响其抗原提呈能力.

表1 慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC表面共刺激分子和MHCⅡ分子的表达(%).

分组	n	HLA-DR	CD1a	CD83	CD86
正常人组	15	53.29±3.65	12.75±3.19	33.61±3.32	39.12±3.54
慢乙肝组	25	33.69±3.26	11.43±3.42	19.74±2.79	19.87±3.13
患肝癌组	13	15.98±2.87	10.88±2.99	9.89±1.88	10.02±2.01

2.2 DC抗原提呈能力

用³H-TdR掺入法测定DC的提呈抗原的能力, 发现慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC的刺激指数低于正常, 而后者更低(P<0.05, 表2)提示其抗原提呈能力较正常低, 诱导特异性免疫反应的能力低下.

表2 DC抗原提呈能力和抗原提呈过程中细胞因子的分泌水平.

组别	n	刺激指数(cpm)	IL-12(pg/mL)	IL-10(pg/mL)	IFNγ(pg/mL)
正常人组	15	15.2±3.8	811.9±306.5	412.7±163.9	739.1±154.5
慢乙肝组	25	9.3±2.6	499.3±238.6	376.1±123.2	419.87±113.1
患肝癌组	13	4.8±2.8	214.9±131.8	359.8±132.9	108.2±52.1

2.3 细胞因子水平

慢性乙肝患者DC提呈抗原的过程中, IFNγ和IL-12的水平低于正常, 即Th1类细胞因子的水平较低, HBV阳性肝癌患者水平最低(P<0.05, 表2), 而IL-10的水平与正常相似(P>0.05), 即Th2类细胞因子的水平无明显改变. 提示慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者的DC诱导细胞免疫反应的能力较低, 而对体液免疫可能无明显影响.

3 讨论

乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)只能在活细胞内以复制的方式进行繁殖, 感染HBV后容易慢性化, 甚至导致肝硬化和原发性肝癌. 而清除HBV主要依赖细胞免疫, 特别是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)通过清除HBV感染的细胞和Th1细胞分泌细胞因子而清除HBV[3]. 树突状细胞(dendritic cells, DC)是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞, 也是惟一能激活初始型T细胞, 诱发原发性免疫反应的细胞. Kurose et al[2]发现HBV转基因小鼠MHCⅡ和CD86的表达水平明显低于正常, 导致DC功能缺陷, 使T淋巴细胞处于无能状态, 造成慢性HBV感染和免疫耐受, 用同系DC进行过继免疫, 则能打破免疫耐受, 诱发特异性CTL反应, 清除HBV. 另有报道发现慢性HBV和HCV感染者及其阳性肝癌患者DC的HLA-DR, CD83和CD86的表达水平低于正常[4], 因此DC的功能与慢性HBV感染甚至原发性肝癌的发生密切相关.

我们所获DC纯度与文献[3]报道的相似. 结果显示慢性HBV感染者与HBV阳性的肝癌患者DC的HLA-DR和共刺激分子的表达水平及提呈抗原的能力较正常细胞低下, 而后者尤为显著. 由此推断HBV感染可导致体内DC提呈抗原的能力降低, 不能充分激活T淋巴细胞, 诱发CTL反应, 使感染容易慢性化. 若进一步降低还可能使机体免疫监视功能严重缺陷, 导致肝癌的发生. 实验发现HBV转基因小鼠DC提呈抗原的能力低下, 而且与Ia表达低下呈正相关, 用IFNγ可以提高DC提呈抗原的能力[2]. 另有报道慢性HBV和HCV感染者DC诱导混合性淋巴细胞反应的能力低下[4], 与本研究所观察的结果相似. 我们还观察了DC提呈抗原的过程中Th1和Th2类细胞因子的水平, 结果表明慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC提呈抗原过程中, Th1类细胞因子IFNγ, IL-12的水平较正常低, 其中肝癌患者更为明显, 而Th2类细胞因子IL-10无明显差别. Ninomiya et al[3]也发现肝细胞癌患者DC诱导同种混合性淋巴细胞反应过程中IL-10和IL-12的水平较正常低. 同时有研究发现慢性HBV和HCV感染者DC在抗原提呈过程中, Th1类细胞因子IFNγ和IL-12的水平低于正常, 而Th2类细胞因子IL-10与正常无明显差别[5], 均与本研究的结果相似. 提示HBV感染者DC诱导特异性免疫反应的能力低下, 造成对HBV感染的免疫耐受, 使感染慢性化甚至导致原发型肝细胞癌的发生.

备注

编辑: N/A

参考文献

1.	Théry C, Amigorena S. The cell biology of antigen presentation in dendritic cells. Curr Opin Immunol. 2001;13:45-51.  [PubMed]  [DOI]

2.	Kurose K, Akbar SM, Yamamoto K, Onji M. Production of antibody to hepatitis B surface antigen (anti-HBs) by murine hepatitis B virus carriers: neonatal tolerance versus antigen presentation by dendritic cells. Immunology. 1997;92:494-500.  [PubMed]  [DOI]

3.	Ninomiya T, Akbar SM, Masumoto T, Horiike N, Onji M. Dendritic cells with immature phenotype and defective function in the peripheral blood from patients with hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 1999;31:323-331.  [PubMed]  [DOI]

4.	Kakumu S, Ito S, Ishikawa T, Mita Y, Tagaya T, Fukuzawa Y, Yoshioka K. Decreased function of peripheral blood dendritic cells in patients with hepatocellular carcinoma with hepatitis B and C virus infection. J Gastroenterol Hepatol. 2000;15:431-436.  [PubMed]  [DOI]

5.	Bender A, Sapp M, Schuler G, Steinman RM, Bhardwaj N. Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood. J Immunol Methods. 1996;196:121-135.  [PubMed]  [DOI]