负载食管癌酸洗抗原树突状细胞诱导高效特异的抗肿瘤免疫

摘要

目的: 研究负载食管癌酸洗抗原树突状细胞(DC)诱导的特异性CTL对食管癌细胞的杀伤效应.

方法: 酸洗涤法获得T.Tn细胞膜抗原多肽, GM-CSF, IL-4和TNF-α体外诱导扩增DC并负载酸洗抗原, 制备食管癌抗原特异性CTL; 用CytoTox 96TM检测其对T.Tn体外杀伤效应.

结果: 负载食管癌抗原肽的DC诱导的特异性CTL对T.Tn的杀伤率达89.4%, 显著高于LAK细胞的杀伤率43.9%(P<0.05). 而对MCC803及Hep2肿瘤细胞株无显著杀伤作用(P<0.05).

结论: 负载食管癌抗原的DC体外可诱导出高效而特异的抗食管癌效应, 提示以DC为中心的肿瘤生物治疗可望提高食管癌综合治疗水平.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: April 19, 2004
Revised: May 2, 2004
Accepted: May 13, 2004
Published online: August 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

肿瘤生物治疗是近年来出现的肿瘤治疗新方法; 也是肿瘤治疗的发展趋势. 树突状细胞(dendritic cell, DC)是功能最强大的"专职"抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs), 具有独特的抗原提呈和激发功能. 作为免疫反应的核心和关键. 在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用, 以DC为中心的肿瘤生物治疗是发展的主要方向之一[1]. 食管癌的治疗手段包括手术、介入治疗、化疗、生物治疗等, 尽管手术技巧不断提高, 化疗药物不断更新, 生物治疗也进行了积极的探索, 但仍然无法彻底解决肿瘤复发与转移的问题. 我们用DC负载酸洗脱食管癌细胞表面的抗原多肽, 体外诱导食管癌T.Tn抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL), 研究其对食管癌T.Tn细胞的杀伤效应.

1 材料与方法

1.1 材料

人食管癌T.Tn和胃癌MGC803 细胞株(购自上海市肿瘤研究所), 人肝癌细胞株HepG2(购自中国人民解放军传染病中心), 人外周血来自正常献血员外周静脉血.

1.2 方法

食管癌T.Tn抗原的制备按照文献[2]方法. 收集培养中对数生长期的T.Tn细胞, 用pH 3.3的柠檬酸洗脱液作用50 s, 然后1 000 r/min, 5min; 小心收集上清液, 置-80 ℃冻存备用. 酸洗后的细胞立即以RPMI 1640 培养基洗涤3遍, 并继续培养, 每24-28 h重复洗脱1次, 每次保证所收集的细胞在1×10⁹/L以上. 所获的酸洗液经SepPakl8去盐柱去盐, 然后收集经Centricon-3超离后的滤液. 获得T.Tn食管癌抗原多肽, 并对酸洗后的细胞进行抗原性检测. 用梯度离心法从食管癌患者外周血中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)悬于含200 mL/L胎牛血清的RPMI1640中, 加rhGM-CSF 500 kU/L, rhIL-4 1 000 kU/L在37 ℃, 50 mL/L CO₂, 条件培养箱中培养. 第3 d向DC诱导体系中加入上述食管癌T.Tn抗原, 与诱导中的DC孵育, 以制备负载食管癌T.Tn抗原的DC. 第5 d加入TNF-α 100 μg/L, 第7 d收集已负载抗原的DC与根据文献[3]分离T淋巴细胞混合培养5 d, 诱导抗原特异性CTL. 以负载抗原DC诱导的抗原特异性CTL, LAK细胞、未负载抗原的单纯DC诱导的T淋巴细胞、食管癌T.Tn抗原直接诱导的T淋巴细胞以及未经诱导的T淋巴细胞作为效应细胞、以T.Tn、MGC803、Hep2为靶细胞, 效靶比分别在1: 12.5、1: 25、1: 50采用CytoTox 96^TM试剂盒进行细胞毒性实验. 杀伤活性(%) = (实验孔A值-效应细胞孔自发释放A值-靶细胞自发释放A值)/(靶细胞最大释放A值-靶细胞自发释放A值) ×100% 统计学处理数据以mean±SD表示, 采用SPSS软件进行t检验分析.

2 结果

食管癌T.Tn特异性CTL对酸洗后的T.Tn杀伤率在各个效靶比均较酸洗前显著降低(P<0.01), 同其对无关肿瘤细胞MGC803和Hep2的杀伤率相比无显著差异(P>0.05, 表1). 负载食管癌T.Tn酸洗抗原DC诱导的CTL对T.Tn有强大的杀伤作用, 与LAK细胞相比有非常显著差异(P<0.01). 单纯负载食管癌T.Tn抗原DC及未经DC诱导的T细胞对T.Tn均无显著杀伤作用, 与对无关肿瘤HepG2类似(表1).

表1 负载酸洗抗原DC诱导的特异性CTL对T.Tn的杀伤作用(%).

	效靶比12.5:1	效靶比25:1	效靶比50:1
CTL+T.Tn (酸洗前)	53.5±8.8	76.52±8.6	89.4±9.5
CTL+T.Tn (酸洗后)	6.1±1.8	7.3±1.9	8.6±2.1
CTL+MGC803	5.5±1.6	8.6±2.1	9.3±3.6
CTL+HepG2	5.2±1.7	7.8±2.4	8.8±3.0
LAK+T.Tn	25.9±5.8	36.9±6.2	43.9±4.9
DC+T.Tn	1.6±1.3	2.0±1.6	2.3±1.8
抗原+T细胞+T.Tn	1.2±1.0	1.6±1.4	2.1±1.6
T细胞+T.Tn	1.1±0.8	1.7±1.0	1.6±1.5
T细胞+HepG2	1.0±0.6	1.1±1.0	1.3±0.9

3 讨论

诱导肿瘤特异性CTL是抗肿瘤免疫反应的关键, 而CTL的特异性取决于肿瘤抗原的特异性. 虽然食管癌特异性抗原尚不明确, 然而T淋巴细胞识别的是结合于肿瘤细胞或APC表面与MHC-I类分子多肽结合沟内的抗原多肽. 因此, 提取这种抗原多肽来诱导CTL, 可以实现对肿瘤的特异性免疫. 微酸洗涤法可以特异地把该多肽分离出来, 而对与MHC-II和其他非MHC结合的抗原无影响, 也不会引起多肽结构改变, 使酸洗物成分相对单一[4]. 因此, 以微酸洗涤T.Tn细胞方法获取肿瘤抗原能够保留其特异性. 我们实验中特异性CTL对酸洗前后的T.Tn杀伤作用的对比也符合此观点. 肿瘤细胞低表达或不表达MHC分子和共刺激分子是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一, 导致抗原不能被有效提呈给T细胞以产生特异性的抗瘤效应. 因此激发有效的T细胞介导的抗瘤免疫反应是提高肿瘤免疫治疗效果的关键. 单纯的抗原不能活化T淋巴细胞, 必须经过APC提呈; 因为T淋巴细胞活化需要抗原和辅助分子双信号才能有效地诱导CTL形成, 发挥抗瘤效应[5].

DC是体内功能最强大的APC, 具有独特的抗原提呈和免疫激发功能, 在肿瘤细胞和T淋巴细胞间起作枢纽和桥梁作用, 因此DC在肿瘤的发生、发展和免疫治疗中发挥着重要的作用[6]. 肿瘤抗原不被DC提呈就不能有效地诱导出抗瘤免疫; 肿瘤组织中的DC分布量与肿瘤的疗效和预后密切相关[7]. 然而, 在肿瘤微环境中, DC数量有限、局部调节DC的活性物质不足以及肿瘤和细胞分泌抑制DC功能的细胞因子等原因, 致使DC抗原提呈能力十分有限[8]. 因此, 在体外进行DC诱导、扩增, 并负载相应的肿瘤抗原, 然后再回输体内, 对肿瘤过继免疫治疗显得十分重要, 这也是当前研究的热点. 我们用食管癌抗原多肽负载DC后诱导食管癌特异性CTL, 结果显示其对食管癌T.Tn细胞株的杀伤率可高达89.4%, 显著高于LAK细胞的作用, 提示DC可有效地捕获、提呈了食管癌抗原并诱导出食管癌抗原特异性CTL, 产生高效的抗食管癌效应; 实验同时显示该特异性CTL对其他类型的肿瘤细胞株MGC803和HepG2则无显著杀伤作用, 提示DC负载食管癌抗原诱导的CTL对食管癌具有高度特异性. 这对临床食管癌疫苗的应用提供了一个思路. 另外, 实验结果显示, 单纯食管癌特异性抗原多肽未经DC提呈而直接刺激T淋巴细胞, 其诱导的T淋巴细胞对T.Tn无显著杀伤作用, 且与未经抗原诱导的T淋巴细胞对T.Tn以及无关肿瘤细胞HepG2的杀伤作用相似, 说明未经DC提呈抗原就不能诱导出有效的肿瘤特异性CTL而发挥抗瘤效应, 充分显示了DC的抗原提呈作用在抗瘤免疫反应中重要地位.

备注

编辑: N/A

参考文献

1.	Okada H, Tahara H, Shurin MR, Attanucci J, Giezeman-Smits KM, Fellows WK, Lotze MT, Chambers WH, Bozik ME. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with a tumor-specific peptide elicit effective anti-tumor immunity against intracranial neoplasms. Int J Cancer. 1998;78:196-201.  [PubMed]  [DOI]

2.	Storkus WJ, Zeh HJ 3rd, Salter RD, Lotze MT. Identification of T-cell epitopes: rapid isolation of class I-presented peptides from viable cells by mild acid elution. J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1993;14:94-103.  [PubMed]  [DOI]

3.	巴 德年.  当代免疫学技术与应用. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 1998; 158-167.  [PubMed]  [DOI]

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