食管癌细胞RNA致敏树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫

摘要

目的: 观察人食管癌细胞株RNA致敏的树突状细胞(DC)所诱导的特异性抗肿瘤免疫效应, 探讨肿瘤细胞RNA直接致敏DC进行食管癌生物治疗的可能性.

方法: 食管癌细胞株T. Tn体外培养, 提取RNA; 正常人外周血, 进行体外DC的培养扩增; 食管癌RNA直接致敏DC, MTT法检测食管癌RNA活化DC所诱生的淋巴细胞对食管癌T. Tn、视网膜母细胞瘤SoRb-70的体外杀伤效应.

结果: 正常人外周血来源的DC, 经食管癌T.Tn细胞株RNA直接致敏后, 成功诱导特异性抗肿瘤免疫反应, T.Tn RNA组CTL在靶效比为20: 1时对T.Tn, SoRb-70的杀伤率分别为85.8%、1.9%, 而对照组对这两种细胞的杀伤率分别为1.0%和0.5%.

结论: 肿瘤RNA致敏DC可以诱导特异性抗肿瘤免疫, 是一种有前景的食管癌治疗手段, 有进一步研究的价值.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: April 19, 2004
Revised: May 2, 2004
Accepted: May 13, 2004
Published online: August 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

食管癌的治疗手段包括手术、介入治疗、化疗、生物治疗等, 尽管手术技巧不断提高, 化疗药物不断更新, 生物治疗也进行了积极的探索, 但仍然无法彻底解决肿瘤复发与转移的问题. 大量研究表明, 通过骨髓、脐血、外周血等途径获取树突状细胞(dendritic cell, DC), 经体外培养、扩增、抗原负载及成熟, 可以打破肿瘤免疫耐受, 诱导强烈的特异性抗肿瘤免疫. 由于食管癌具有异质性大、抗原性弱, 缺乏特异性肿瘤抗原的特点, 和多数肿瘤一样不能激发有效的免疫反应[1], 同时食管癌标本污染重, 难以体外培养及保证无菌等, 使得DC难以广泛用于食管癌的免疫治疗. 近年来文献[2-3]报道肿瘤细胞RNA致敏DC可以诱导强烈的抗肿瘤免疫, 但在人类食管癌方面尚无报道. 我们研究了人食管癌细胞RNA致敏DC的免疫效应如下.

1 材料和方法

1.1 材料

人食管癌细胞株T.Tn, 购自上海中科院细胞研究所; 人视网膜母细胞瘤细胞株SoRb-70, 购自湖南医科大学肿瘤研究所; 二甲亚砜和MTT为Sigma产品; Trizol试剂盒为上海生工产品; rhGM-CSF, rhIL-4, rhIL-2, CD1a单抗为Immunotech产品; 淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂.

1.2 方法

常规培养细胞, 以Trizol试剂盒对培养的细胞进行RNA抽提, -20 ℃保存. 部分用于测定260 nm和280 nm吸光度A值, 估计纯度并定量. 部分进行RNA电泳, 观察18 S和28 S条带的完整性. 自健康志愿者抽取外周血100 mL, 以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMNC), 在37 ℃和 50 mL/L CO₂饱和湿度条件下培养 4 h, 取贴壁细胞, 加入完全培养基和细胞因子rhGM-CSF 800 kU/L, rhIL-4 500 kU/L在37 ℃和50 mL/L CO₂饱和湿度条件下培养. 倒置显微镜下观察细胞形态, 第3, 7, 24 d流式细胞仪检测CD1a阳性细胞比例. 第7 d收获细胞作为DC用于RNA致敏. 培养7 d的贴壁PBMNC分成2组, 重悬于RPMI 1640培养基中. 实验组直接加入T.Tn RNA10 pg/DC, 对照组不加RNA. 混匀后在50 mL/L CO₂、37 ℃、饱和湿度条件下培养4 h, 制备效应细胞, 用于淋巴细胞的活化. RNA致敏的同时, 取同一志愿者外周血100 mL, 同上方法制备PBMNC, 贴壁4 h后取非贴壁细胞, 作为淋巴细胞来源. 将T.Tn RNA致敏的DC和未经RNA致敏的DC, 分别按1: 100的比例加入自体非贴壁PBMNC, 混匀后在37 ℃, 50 mL/L CO₂ , 饱和湿度, rhGM-CSF 800 kU/L、rhIL-4 500 kU/L、rhIL-2 100 kU/mL条件下共同培养3 d, 活化淋巴细胞, 制备效应细胞. 在96孔塑料培养板中每孔加入T.Tn细胞1×10⁴, 按照效应与靶细胞比例1: 1, 1: 10, 1: 20, 分别加入T.Tn RNA致敏DC所活化的淋巴细胞和未经T.Tn RNA致敏DC所活化的淋巴细胞. 每种条件设3个复孔, 并分别设立效应细胞和肿瘤细胞平行对照孔. 孵育4 h后, 各孔分别加入5 g/L MTT溶液, 再次孵育4 h, 离心沉淀, 弃去上清, 每孔加入0.2 mL DMSO(二甲亚砜), 震荡溶解10 min, 用酶联免疫检测仪, 波长570 nm, 测定各孔吸光度A值. 计算杀伤率＝(靶细胞A十效应细胞A-效靶细胞杀伤反应后A)/靶细胞A×100% 同样方法96孔培养板中加入SoRb-70细胞, 按上法测定不同方法活化的非贴壁PBMNC细胞对SoRb-70细胞的体外杀伤效应, 并计算杀伤率.

2 结果

T.Tn细胞经Trizol试剂盒抽提的RNA, 经电泳可见到完整的18S和28S条带, 分光光度计检测A260/A280 = 1.84, >1.8. 正常PBMNC贴壁后得到贴壁细胞. 培养3 d后可见悬浮的细胞群落, 有短的突起. 7 d左右大部分悬浮细胞有大量毛刺, 具有典型的DC形态. 流式细胞仪检测CD1a阳性细胞随时间增加也相应增加, 第3, 7, 24 d CD1a阳性细胞率分别为6.5%、46.9%和65.3%. T.Tn RNA致敏DC活化非贴壁PBMNC时, 可见淋巴细胞在DC周围呈花环样聚集, 同样活化淋巴细胞对T.Tn细胞体外杀伤实验时, 可见淋巴细胞在肿瘤细胞周围簇状聚集; 而未经T.Tn RNA致敏DC活化非贴壁PBMNC时, 以及两组淋巴细胞对SoRb-70细胞体外杀伤实验时, 均未见到明显的淋巴细胞聚集效应. T.Tn RNA致敏DC诱导的CTL对T.Tn有强大的杀伤作用, 而未经T.Tn RNA致敏DC诱导的T细胞对T.Tn无显著杀伤作用, 与对无关肿瘤SoRb-70类似, 二者相比有非常显著差异(P<0.01, 表1).

表1 T.Tn RNA致敏DC所活化的淋巴细胞对不同肿瘤的杀伤率(%).

	T.Tn RNA致敏组/效靶比			未经T.Tn RNA致敏组/效靶比
	1: 1	10: 1	20: 1	1: 1	10: 1	20: 1
T.Tn	58.8±8.6	72.4±8.8	85.8±9.6	2.4±1.9	1.8±1.2	2.0±1.7
SoRb-70	1.1±1.0	1.3±1.1	1.1±1.0	0.4±0.2	0.6±0.3	0.5±0.2

3 讨论

肿瘤RNA被DC摄取, 在DC内翻译成相应的蛋白质, 经过抗原处理加工, 被加工成抗原肽, 被运送到DC表面, 通过MHC限制性途径, 激活T细胞, 发挥特异性抗肿瘤效应[4]. 至今对肾癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤进行了这一方法的尝试, 取得了良好的效果. 在食管癌方面, 国内还未见报道. 我们采用常规方法培养扩增DC, 将食管癌T.Tn细胞RNA在无血清培养体系中直接致敏DC在体外杀伤实验中, 食管癌细胞T.Tn RNA致敏DC所活化淋巴细胞, 对食管癌细胞株T.Tn的杀伤率在效靶比为20: 1时达到85.8%, 而对无关肿瘤视网膜母细胞瘤SoRb-70细胞杀伤率很低; 未经RNA致敏的DC所活化淋巴细胞, 对T.Tn和SoRb-70的体外杀伤率都很低. 表明这种抗肿瘤免疫具有肿瘤特异性, 同时也说明从食管癌T.Tn细胞提取的RNA具有完整的功能, 通过致敏可以实现肿瘤抗原的抗原加工递呈.

肿瘤RNA致敏DC治疗包括食管癌在内的恶性肿瘤, 具有明显的优势, 如RNA可以从少量肿瘤细胞中提取并体外扩增, 解决抗原制备时肿瘤细胞来源有限的问题[5]; 其次无需知道肿瘤抗原的确切成分[6]; 另外也可轻易解决手术标本伴有细菌污染的问题等. 对食管癌标本抽提RNA, 直接致敏DC, 我们也观察到相似的体外杀伤效果, 整个培养体系末出现细菌污染(待发表). 这一方法目前也存在一定的不足, 如RNA致敏的最佳时机、剂量, 是否需要载体以及使用何种载体还没有定论, RNA的稳定性问题也没有完全解决等. 我们采用肿瘤RNA直接致敏培养7 d的DC, 剂量为10 pg RNA/DC, 取得良好的体外实验效果.

随着对DC的功能和RNA致敏机制的进一步认识, 肿瘤RNA致敏DC治疗恶性肿瘤必将受到更多重视. 今后发展方向主要是通过消减PCR差异或显示PCR获取并扩增肿瘤组织中差异表达的基因, 以RNA的形式致敏DC既达到诱导强烈抗肿瘤免疫的目的, 同时又可有效避免可能出现的严重自身免疫损害.

备注

编辑: N/A

参考文献

1.	Chen L. Immunological ignorance of silent antigens as an explanation of tumor evasion. Immunol Today. 1998;19:27-30.  [PubMed]  [DOI]

2.	Mitchell DA, Nair SK. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J Clin Invest. 2000;106:1065-1069.  [PubMed]  [DOI]

3.	Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, Coleman DM, Dahm P, Vieweg J. Human dendritic cells transfected with renal tumor RNA stimulate polyclonal T-cell responses against antigens expressed by primary and metastatic tumors. Cancer Res. 2001;61:3388-3393.  [PubMed]  [DOI]

4.	Liu M. Transfected human dendritic cells as cancer vaccines. Nat Biotechnol. 1998;16:335-336.  [PubMed]  [DOI]

5.	Boczkowski D, Nair SK, Nam JH, Lyerly HK, Gilboa E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 2000;60:1028-1034.  [PubMed]  [DOI]

6.	Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, Wu NZ, Dahm P, Pruitt SK, Boczkowski D, Nair SK, Ballo MS, Gilboa E. Induction of polyclonal prostate cancer-specific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA. J Immunol. 2001;166:2953-2960.  [PubMed]  [DOI]