免疫性肝损伤中一氧化氮诱生对CYP2E1表达及代谢活性的影响

摘要

目的: 研究BCG诱发啮齿类免疫性肝损伤过程中NO诱生对CYP2E1表达及代谢活性的影响.

方法: 采用尾静脉注射BCG诱发小鼠及大鼠产生免疫性肝损伤, 紫外分光光度法测定肝微粒体中CYP450全酶含量, 免疫组化法测定肝组织CYP2E1蛋白表达, HPLC法测定经CYP2E1代谢的探针药物氯唑沙宗血药浓度经时变化.

结果: BCG刺激可致肝组织炎性细胞浸润形成大量肉芽肿, 肝微粒体CYP450全酶含量降低, 肝脏CYP2E1蛋白表达下调, CYP2E1代谢底物氯唑沙宗血药浓度-时间曲线右移. 选择性iNOS抑制剂氨基胍可逆转BCG所致肝脏CYP450全酶含量降低, 增加CYP2E1蛋白表达, 增强CYP2E1对探针药物氯唑沙宗的代谢活性.

结论: NO诱生机制参与了BCG免疫性肝损伤中CYP450全酶含量降低, CYP2E1表达下调及代谢活性的下降.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: March 18, 2004
Revised: April 12, 2004
Accepted: April 20, 2004
Published online: August 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)药物代谢酶系超家族是参与各种外源性药物或内源性激素等氧化代谢的关键酶源, 其中主要在肝脏表达的CYP2E1是重要的CYP450酶亚型之一. CYP2E1的动物实验对人临床药物代谢动力学研究有重要价值[1]. 近年来有关感染或炎症等免疫刺激因素对CYP2E1的影响及调节机制受到关注[2-7]. BCG所致免疫性肝损伤模型, 是确实可靠的iNOS诱生模型[8-9]. 我们以NOS抑制剂氨基胍及L-NAME作为工具药, 采用免疫组化法及高效液相色谱法(HPLC)等研究手段, 在CYP450全酶含量、CYP2E1酶蛋白表达及CYP2E1代谢活性等不同环节, 探讨免疫性肝损伤中NO诱生对CYP2E1代谢调节中的作用及机制.

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c近交系小鼠, ♂, 体质量20±2 g, 及SD大鼠, ♂, 体质量280±20 g, 由北京大学医学部实验动物中心提供. BCG冻干粉及氯霉素对照品购自中国药品生物制品检定所. iNOS兔抗人IgG抗体购自北京中山生物技术有限公司. CYP2E1多克隆lgG抗体购自美国Reseach Diagnostics, INC公司. Powervision二抗为美国Santa Cruz产品, SP-9003免疫组化染色试剂盒、AEC酶底物试剂盒、GVA封片剂购自北京中山生物技术有限公司. 氨基胍、L-精氨酸甲酯 (N^ω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)、细菌脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品. 氯唑沙宗对照品、氯唑沙宗片剂, 山东省医药工业研究所. 乙腈, 加拿大CALEDON 公司, 色谱纯.

M840型高压液相色谱仪(美国Waters公司), 配以510泵, U6K进样阀, M490型全波长紫外检测器, SSEXsil ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm). XL-90型超高速离心机(美国Beckman公司). 冰冻切片机(德国LEICA公司). TU-1900双光束紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司). TGL-16G低温高速离心机 (上海安亭科学仪器厂).

1.2 方法[9]

取BALB/c小鼠54只, 随机分为6组, 每组9只, 即空白对照组、BCG免疫损伤模型组、BCG +LPS组、BCG +氨基胍组、BCG +L-NAME组及氨基胍对照组. 除空白对照组及氨基胍对照组外, 将免疫刺激各组小鼠经尾静脉1次注射BCG(125 mg/kg, 2 wk), 制备免疫性肝损伤动物模型. BCG刺激1 wk后, 给予BCG+氨基胍组隔日1次ip氨基胍(50 mg/kg, ×3), BCG+L-NAME组隔日1次ip L-NAME (50 mg/kg, ×3). 于BCG刺激2 wk后, 给予BCG+LPS组经尾静脉1次注射LPS(125 mg/kg)刺激12 h. 氨基胍对照组于实验1 wk给予空白鼠隔日1次ip氨基胍(50 mg/kg, ×3). 在BCG刺激2 wk后处死小鼠, 每组取7只小鼠肝脏经超高速离心法制备肝微粒体样本, 取另2只小鼠肝脏经40 g/L多聚甲醛固定, 石蜡包埋切片(5 μm), 进行免疫组织化学测定. 取SD♂大鼠15只, 随机分为以下3组: 空白对照组、BCG免疫性肝损伤模型组、BCG＋氨基胍组, 每组5只. 将免疫刺激各组大鼠经尾静脉1次注射BCG(125 mg/kg, 2 wk). BCG刺激1 wk后, 给予BCG+氨基胍组隔日1次ip给予氨基胍50 mg/kg, ×3. 上述3组大鼠均于实验2 wk后上午08: 00 经灌胃单次给予探针药物氯唑沙宗(50 mg/kg), 并分别于给氯唑沙宗后 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 h各时间点从眼内眦静脉丛采血0.5 mL, 离心取血浆, 保存在-20 ℃冰箱中待用于HPLC测定. 以上动物实验均重复3次. 于卡介苗刺激2 wk后, 取上述6组小鼠颈椎脱臼处死, 立即用冰冷的生理盐水经肝门静脉插管灌流, 冲去肝组织内残血, 取肝脏, 摘除胆囊, 称肝, 冰浴中按1: 4比例加入0.3 moL/L冷蔗糖溶液, 制备肝匀浆, 高速离心 (9 000 g×15 min, 4 ℃)后取上清液, 超高速离心(10 0000 g×60 min , 4 ℃), 弃去上清, 沉淀中加0.15 moL/L Tris-HCl(pH 7.6) 5 mL, 吹打洗涤以除去污染的血红蛋白, 继续超高速离心(100 000 g×60 min, 4 ℃)弃去上清, 沉淀中按1 mL/g肝加入0.3 moL/L蔗糖-15 mmoL/L Tris-HCl (pH 7.6)重悬(2 mL), 终产物为肝微粒体混悬液, 置-20 ℃冰箱中储存待测. 肝微粒体混悬液中按1: 4比例加入预冷的0.15 moL/L Tris-HCl缓冲液, 通入CO气体2 min, 联二亚硫酸钠还原样本后, 用紫外分光光度计测定490-450 nm处吸光度差值. 采用考马斯亮兰法测定肝微粒体中蛋白的含量, 以牛血清白蛋白作标准曲线, 计算每克肝微粒体蛋白中CYP450全酶含量.

1.2.1 肝组织iNOS及CYP2E1免疫组化染色: 将裱贴于硅烷化载玻片上的小鼠肝组织切片, 常规系列乙醇脱蜡至水. 30 mL/L过氧化氢阻断内源性过氧化氢酶, 微波加热法修复抗原, 5-10 mL/L山羊血清封闭后, 滴加适当比例稀释的CYP 2E1一抗4 ℃过夜. 滴加生物素标记链酶卵白素二抗, AEC显色, 自来水冲洗, 苏木精复染核后封片. 光镜下观察免疫组化染色结果. CYP 2E1抗体稀释度: 1: 100.

1.2.2 HPLC测定CYP 2E1代谢活性[10]: 通过测定血浆中探针药物氯唑沙宗药-时曲线及药代动力学参数的变化, 计算CYP 2E1代谢活性. 色谱流动相为乙晴 : 5 g/L醋酸 = 30: 70, 检测波长为287 nm, 紫外检测器灵敏度为0.01AUFS, 流速为1 mL/min. 取大鼠血浆0.2 mL, 加入氯霉素内标液40 μL (128 mg/L)、再加萃取剂乙酸乙酯2 mL, 振荡3 min后离心3 000 r/min×10 min, 吸取上层有机相移至另一5 mL试管中, 将试管置于37 ℃水浴中, 氮气缓慢吹干. 以0.5 mL流动相溶解残渣, 混匀后取40 μL进样测定. HPLC方法学考察: 氯唑沙宗色谱峰及氯霉素内标峰的保留时间分别为9.66 min和5.77 min, 二者分离良好, 且无血浆中内源性物质所致杂峰干扰. 血浆样品中氯唑沙宗标准曲线在0.5-10 mg/L范围内的线性关系良好, 其相关系数 r = 0.9 998. 血浆高中低三种氯唑沙宗药物浓度(1、2、5 mg/L)的回收率在98.99-105%之间, 其最低检测浓度(LOQ)为200 μg/L. 血浆样本检测的日内差异和日间差异(RSD)在6.71-10.00%范围内. 结果显示血浆样本HPLC法测定的特异性、线性范围和检测下限、回收率和精密度均可满足实验要求.

统计学处理 结果以平均值±标准差(mean±SD)表示, 显著性分析采用ANOVA, Duncan's test, SPSS11.0进行方差分析处理, 组间比较采用双侧t检验.

2 结果

2.1 抑制NO诱生对免疫性肝损伤中CYP450全酶含量的影响

BCG组及BCG+LPS组CYP450全酶含量均显著低于空白对照组(P<0.05, 表1). 在BCG刺激的基础上给予NOS抑制剂氨基胍(选择性)或L-NAME(非选择性), 二者均可使被BCG抑制的CYP450全酶含量显著升高(P<0.05). 而单独给予氨基胍组的CYP450全酶含量与空白对照组相比未见显著性差异.

表1 NO诱生对BCG所致免疫性肝损伤小鼠肝质量、肝质量/体质量比值及肝微粒体CYP450全酶含量的影响(mean±SD).

Group	n	Liver mass (g)	Lmass / B mass (%)	n	CYP450 (μmoL/g)
Control	10	1.21±0.21	5.00 ±0.60	7	1.94±0.45
BCG (125 mg/kg)	10	1.84±0.28a	8.20±0.50a	7	0.97±0.15b
BCG+LPS (125 μg/kg)	10	1.63±0.17ac	7.20±0.80a	6	1.33±0.29a
BCG+氨基胍(50 mg/kg)	10	1.91±0.17a	8.70±0.50ac	7	1.86±0.81c
BCG+L-NAME(50 mg/kg)	10	1.83±0.25a	8.40±0.70a	7	1.92±0.66c
氨基胍(50 mg/kg)	10	1.43±0.17ac	5.80±0.20ac	7	1.95±0.60c

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组;

^cP<0.05 vs BCG组.

2.2 抑制NO诱生对免疫性肝损伤中CYP2E1蛋白表达的影响

CYP2E1在空白对照组肝细胞胞质中即有一定量红色阳性固有表达. BCG刺激所致免疫性肝损伤模型组可见CYP2E1蛋白表达明显减少, 在BCG刺激的基础上加用LPS则使CYP2E1蛋白表达进一步减少. 选择性iNOS抑制剂氨基胍(50 mg/kg)或非选择性NOS抑制剂L-NAME(50 mg/kg), 均可使被BCG抑制的CYP2E1蛋白表达明显增强. 与空白对照组相比, 单独给予氨基胍(50 mg/kg)亦可使CYP2E1阳性表达染色略有增强.

2.3 抑制NO诱生对免疫性肝损伤中CYP2E1代谢活性的影响

分别给予正常大鼠和BCG免疫性肝损伤模型大鼠单次口服经CYP2E1代谢的探针药物氯唑沙宗50 mg/kg, 在给药后10 h内氯唑沙宗血药浓度与正常对照组大鼠相比, BCG肝损伤组口服氯唑沙宗后, 各时间点血药浓度均显著增高, 氯唑沙宗母药代谢抑制(P<0.05, 表2); 加用氨基胍则可使BCG刺激所抑制的氯唑沙宗各时间点血药浓度显著降低, 氯唑沙宗母药代谢增强(P<0.05).

表2 NO诱生对BCG所致免疫性肝损伤大鼠口服氯唑沙宗后血药浓度的影响(mean±SD, n = 5).

t/h	氯唑沙宗血药浓度(mg/L)
	Control	BCG	BCG+氨基胍
0.5	11.88±3.17	16.27±2.78a	7.30±2.73c
1	12.54±4.09	15.3±5.41	5.01±2.16c
2	4.00±1.43	9.95±60	1.88±0.69c
3	1.46±0.54	7.70±3.11a	0.98±0.37c
4	0.81±0.79	4.90±3.00a	1.12±0.64c
8	0.26±0.14	0.94±1.13	0.34±0.07

^aP<0.05 vs 对照组;

^cP<0.05 vs BCG组.

如表3所示, BCG模型组大鼠血药峰浓度(Cmax)较空白对照组增加了37%(P<0.05), 药时曲线下面积(AUC)增加了146%(P<0.05); 氨基胍则可使BCG刺激所增加的Cmax和AUC显著降低(P<0.05, 表3). 而3组间的血浆半衰期(T1/2)、血药达峰时间(Tmax)和消除速率常数(Ke)未见显著性差异(P>0.1).

表3 NO诱生对BCG所致免疫性肝损伤大鼠口服氯唑沙宗后血浆药代动力学参数的影响(mean±SD, n = 5).

Group	Control	BCG	BCG + 氨基胍
AUC (h*mg/L)	23.32±6.60	57.49±18.79a	13.73±2.95c
T1/2 (h)	2.10±0.43	1.64±0.32	1.88±0.22
Cmax (mg/L)	13.51±3.47	18.58±1.30a	9.97±4.18c
Tmax (h)	0.80±0.27	0.80±0.27	0.60±0.22
Ke (h-1)	0.34±0.08	0.43±0.09	0.37±0.04

^aP<0.05 vs 对照组;

^cP<0.05 vs BCG组.

3 讨论

在肝脏由于感染与炎症等所诱生的大量炎性细胞因子, 可导致CYP450酶系对多种药物代谢的表型发生改变[11]. 可激活肝内居留的巨噬细胞(Kupffer细胞), 诱生大量内源性的炎性细胞因子导致免疫性肝损伤[12]. 上述炎性细胞因子, 可诱导肝实质细胞或肝Kupffer细胞表达iNOS, 继而生成大量NO [13-14]. 结果显示, 在BCG免疫性肝损伤模型, 不仅可观察到大量iNOS的诱生及表达, 同时亦可观察到肝微粒体CYP450全酶含量显著下降. 在BCG刺激的基础上合用LPS, 则使iNOS表达进一步增加, 并生成更多的NO, 从而使CYP450全酶含量进一步降低. 给予NOS抑制剂氨基胍或L-NAME以减少NO的生成, 可逆转BCG所致肝微粒体CYP450全酶含量降低. 结果提示NO参与了BCG所致CYP450全酶含量下降, 抑制iNOS不仅可以保存CYP450全酶, 而且可以保存CYP450的基础表达.

CYP2E1主要与酒精性肝病等化学肝损伤过程中的毒物代谢密切相关[15]. 免疫刺激诱生的NO亦有可能对CYP2E1代谢能力发挥重要影响[16-17]. 我们采用免疫组化法观察肝脏CYP2E1酶蛋白表达、高效液相色谱法(HPLC)检测CYP2E1对血浆中代谢底物氯唑沙宗浓度的经时变化等不同手段, 观察NO诱生对CYP2E1的影响. 结果显示, CYP2E1在空白对照组小鼠肝脏中即显示有一定量的固有表达, BCG免疫性刺激条件下, 可导致小鼠肝实质细胞中CYP2E1表达明显减少, 采用BCG+LPS刺激则使CYP2E1蛋白表达进一步减少. 反之, 选择性iNOS抑制剂氨基胍可逆转BCG对小鼠肝实质细胞内CYP2E1酶蛋白表达的抑制作用. 在无BCG免疫刺激条件下, 氨基胍亦可使空白对照组CYP2E1酶蛋白阳性表达增强. HPLC结果显示, BCG组在给予氯唑沙宗后各时间点血药浓度均较相同时间点对照组浓度增高, 即CYP2E1的肝脏特异性探针药物氯唑沙宗在单位时间内的全身消除减少. 氨基胍则可逆转BCG所致氯唑沙宗原形药的血药浓度-时间代谢曲线右移, 提示免疫性肝损伤过程中诱生的NO对CYP2E1酶蛋白在代谢活性水平亦有直接的抑制作用.

备注

编辑: N/A

参考文献

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