河南抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者病毒前C区1896位点的突变及临床意义

摘要

目的: 了解抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者HBV前C区1896位点的突变状况.

方法: 应用3'碱基特异聚合酶链反应(3'BS-PCR)结合PCR产物直接测序法检测前C区热点突变.

结果: 72例抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者HBV前C区1896位点突变检出率为34.7%; 慢性肝炎重度患者19例检出8例单纯突变株感染, 其检出率显著高于慢性肝炎轻度组(P<0.05); 慢性肝炎重度组总突变率(47.4%)亦显著高于慢性肝炎轻度组(17.4%)(P<0.05); 16例患者经测序发现有1例存在前C 1899位点G→A点突变.

结论: 河南地区抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者存在一定比例的病毒变异株; HBV前C区1896位点的变异与慢性肝炎进展程度相关.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: April 15, 2004
Revised: April 20, 2004
Accepted: May 13, 2004
Published online: August 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染和复制与乙型肝炎慢性化、肝硬化和肝癌发生密切相关[1-2]. 在慢性HBV感染的患者中常有不少病例表现为HBeAg阴性、抗-HBe阳性、而HBV DNA阳性, 表明病毒仍复制活跃, 此类患者病变可持续活动, 甚至发展为重症肝炎[3] . 很多资料显示该类型患者HBV DNA前C区存在变异[4-5] . 我们应用3'碱基特异聚合酶链反应(3'BS-PCR)结合PCR产物直接测序法, 对72例抗-HBe阳性、HBV DNA阳性患者所携带的HBV前C基因区进行变异分析如下.

1 材料和方法

1.1 材料

1999-05/2001-10我所抗-HBe阳性慢性乙型肝炎72例. 其中男52例, 女20例, 年龄22-63岁; 慢性肝炎轻度(CMiH)23例, 慢性肝炎中度(CMoH) 30例, 慢性肝炎重度(CSH) 19例. 诊断参照1995年修订的病毒性肝炎诊断标准. 无其他类型肝炎病毒重叠感染, PCR-HBV DNA全部为阳性, 使用华美生物工程公司PCR试剂盒, 扩增仪为英国产Genius. 采用ELISA法检测患者血清HBV Markers, 所有病例HBeAg均为阴性, 试剂盒为潍坊3V公司生产.

1.2 方法

3'BS-PCR扩增根据参考文献[2,6] 设计三条PCR引物: P1 (1 879-1 896)5'-GTG CCT TGG GTG GCT TTG-3'; P2(1 879-1 896)5'-GTG CCT TGG GTG GCT TTA-3'; P3 (2 235-2 253)5'-TAC TCA AGA ACA GTT TCT C-3', 由北京赛百盛公司合成. 其中引物P1 3'末端碱基为野生型(G), 引物P2 3'末端碱基为突变型(A). 引物P3 分别与引物P1 和引物P2 配对扩增, 产物长度为375 bp. 样品DNA提取方法按文献[7] 进行. 扩增方法: 50 μL的3'BS-PCR反应体系中包括各20 pmoL的引物P1 (或P2 )和引物P3 , 1.5 mmoL/L MgCl₂ , 50 μmoL/L dNTP, 5 μL提取的HBV DNA模板, 1.5U Taq酶. 于PCR仪中94 ℃预变性２min后, 按94 ℃ 40 s , 61 ℃ 30 s , 72 ℃ 1 min 循环30次, 最后72 ℃延伸５min. 反应产物在15 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 以pUC19 DNA/MspI(HpaⅡ) Marker作为参照, 溴乙锭染色, 紫外灯下观察, 出现375 bp长度的片段者即为扩增的靶序列产物. 序列分析则根据已发表的乙型肝炎病毒基因序列(adr亚型), 在病毒基因前Ｃ区1896位点的上游和下游各设计一条引物, 其核苷酸序列分别为: 上游引物P４(1 695-1 715)5'-CTT GAA GCA TAC TTC AAA GGA-3'; 下游引物P5 (1 955-1 975) 5'-CGG AAA GAA GTC AGA AGG CAA-3', 由美国Integrated DNA Technologies, Inc合成 . PCR产物测序工作在美国Salk研究所完成.

统计学处理 使用SPSS10.0软件包, x²检验.

2 结果

以引物P1 或P2 与P3 配对, 以及HBV DNA前C基因1896位点上、下游引物配对(P₄ +P₅ ), 经PCR扩增后72份血清标本全部为HBV DNA阳性, 与华美生物工程公司PCR筛选实验结果相符; 另外选取10名健康献血员血浆标本, 以设计的引物扩增(P₁+P₃, P₂+P₃, P₄ +P₅), 结果均为阴性, 证实本实验设计的引物敏感性和特异性达到实验要求. 从72份HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者血清中, 随机抽取16份, 以引物P4 +P5进行PCR扩增后直接进行测序, 结果出现５例前Ｃ区1896位核苷酸Ｇ→Ａ突变, １例1896G→Ａ突变, 未出现其他位点突变. 由于引物P₁ 3'末端碱基为野生型碱基G, 引物P2 3'末端碱基为突变型碱基Ａ, 因而引物P₁ +P₃ 组合能扩增出阳性条带者为野生型病毒株, 引物P₂ +P₃组合PCR阳性者则为突变型病毒株. P₁ +P₃组合和P₂ +P₃组合PCR均能扩增出特异性阳性条带, 则为野生与突变株混合感染(图１). 以已测序的16份已知野生株和突变株血清标本进行3'BS-PCR分析, 以探测最佳退火温度点. 当退火温度设置为61℃时, 3'BS-PCR分析法测出的突变与测序分析结果完全相符. 以此实验条件对72例慢性乙型肝炎患者血清标本进行3'BS-PCR扩增, 共检出25例病毒突变株, 突变率为34.7%. 其中混合感染(即P₁+P₃ 和P₂+P₃均阳性)者为11例, 占15.3%; 单纯突变株感染(仅P2 +P3阳性)为14例, 占19.4%(表1).

表1 慢性乙型肝炎患者前C区1896位点突变状况n(%).

分组(类型)	n	野生株	单纯突变株	混合感染	变异总数
Ⅰ(慢性肝炎轻度)	23	19 (82.6)	1 (4.4)	3 (13.0)	4 (17.4)
Ⅱ(慢性肝炎中度)	30	18 (60.0)	5 (16.7)	7 (23.3)	12 (40.0)
Ⅲ(慢性肝炎重度)	19	10 (52.6)	8 (42.1)a	1 (5.3)	9 (47.4)a
合计	72	47 (65.3)	14 (19.4)	11 (15.3)	25 (34.7)

^aP<0.05 vs GroupⅠ.

3 讨论

当乙型肝炎患者血清中HBeAg消失抗-HBe产生后, 通常认为意味着病毒复制的停止和病变的改善. 但抗-HBe阳性患者仍有部分病例HBV DNA阳性及病变持续[8]. 1989年Carman et al[9] 首次发现HBV DNA前C区1896位点的G→A突变, 可使编码色氨酸的密码子TGG突变为终止密码子TAG, 导致HBeAg的合成终止. 由于降解的HBcAg与HBeAg有交叉免疫原性[10], 因而可导致抗-HBe的产生, 但病毒复制仍然活跃, 可造成不同程度的肝损伤, 出现肝功能异常[11]. 本结果显示, 72例抗-HBe阳性的慢性乙型肝炎患者, 有25例出现前C区1896位G→A点突变, 突变率为34.7%, 表明河南地区也存在一定比例的乙型肝炎病毒变异株感染. 建议对于抗-HBe出现, 但HBV DNA仍阳性的患者应首先考虑变异株感染的可能性. 前C区1896位点突变率资料报道差异较大, 其原因可能是因所选择的研究对象不同及所采用的检测点突变的方法不同或由于地区差异而造成. 本研究72例抗-HBe阳性患者单纯前C基因1896位点突变仅有14例(19.4%), 其他无此终止密码变异的HBeAg阴性病例中也可能存在其他位点的突变. 如1899, 1858及1862位点的单个或联合突变[12], 前C启动子的碱基突变[13-14], 也可能不同程度地影响HBeAg的合成或分泌. 有报道慢性肝炎重度病例前C1896位点突变率要显著高于慢性肝炎轻度组[15], 本文亦证实总突变率和单纯突变率在慢性肝炎重度组均显著高于慢性肝炎轻度组(P<0.05), 提示这种变异与慢性肝炎进展程度有关. 另外我们对16例标本进行了测序分析, 在5例变异株中发现有1例同时存在1899位G→Ａ点突变, 使编码甘氨酸的密码子GGC突变为编码天冬氨酸的密码子GAC, 其突变的临床意义的改变目前尚不清楚. 有报道前C 1896和1899位点的联合突变者出现更为严重的临床症状, 而仅有1896位点变异的病例则症状相对较轻[16] . 1896位点至1899位点有连续4个腺嘌呤核苷酸(G)残基相邻, 在HBV DNA复制过程中所造成的碱基错配几率相对要大. 目前多认为1896位点的终止密码突变是由于宿主的免疫反应压力, 持续的慢性感染及抗病毒药物治疗的压力造成的, 由于HBeAg是细胞毒T细胞(CTL)攻击的靶抗原, 因而这种变异是病毒逃避宿主免疫应答的一种方式, 使病毒可持续感染, 造成慢性化[16].

目前检测HBV前C区变异的方法主要有PCR扩增产物直接测序法[17], 3'BS-PCR法[2], PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)[18]等. 测序法不仅能检测到热点变异, 还可检测到其他位点的突变及缺失. 但该方法费时费力, 价格昂贵, 且只能检测到优势毒株, 无法检测到混合感染状况. 3'BS-PCR法是根据引物3'末端碱基只有与靶序列相对应的碱基互补时才能扩增出所需片段的原理而设计的, 其显著优点是能检测到混合感染, 且操作简便, 成本低, 特别适合于大规模筛查. 本法主要缺陷是不够稳定. 但根据多年的操作经验, 我们认为3'BS-PCR的关键是找到最佳退火温度和退火时间, 因而应以一定数量的已知变异的血清标本(测序证实)进行质控, 有条件的可利用梯度PCR仪, 并尽量在短时间内操作完毕. 本实验在固定试剂和仪器下, 当退火温度和时间在61℃ 30 s时, 其变异株检出率与测序法完全相符. 但不同实验条件下(主要是试剂和PCR扩增仪), 其退火温度和时间亦应不同. 只要严格找到并掌握最佳实验条件, 本法对于测定定点突变还是具有很好的应用价值.

备注

编辑: N/A

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