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世界华人消化杂志. 2004-08-15; 12(8): 1853-1856
在线出版日期: 2004-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i8.1853
胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞移植对糖尿病鼠的治疗作用
刘星霞, 缪兵, 李府, 马秀峰, 时庆, 沈柏均
刘星霞, 李府, 马秀峰, 时庆, 沈柏均, 山东大学齐鲁医院低温医学研究室 山东省济南市 250012
缪兵, 山东大学医学院生理学研究所 山东省济南市 250012
刘星霞, 女, 1970-01-07生, 山东省临清市人, 汉族. 1996年上海医科大学医学硕士, 2002年山东大学博士生. 主要从事干细胞诱导分化及移植治疗研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30271248.
通讯作者: 沈柏均, 250012, 山东省济南市, 山东大学齐鲁医院低温医学研究室. shenbaijun@21cn.com
电话: 0531-2169215 传真: 0531-6927544
收稿日期: 2004-02-11
修回日期: 2004-02-12
接受日期: 2004-02-13
在线出版日期: 2004-08-15

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞ES-D3诱导生成的胰岛素分泌细胞(IPCs)皮下移植对糖尿病(DM)模型小鼠的血糖及一般状况的影响.

方法: 首先, 将ES-D3细胞培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增, 对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM诱导培养液使其进行分化; 其次, 采用STZ(剂量: 200 mg/kg)一次性腹腔注射Balb/c小鼠制备DM模型; 最后, 将诱导21 d的IPCs行肩胛部皮下移植给DM小鼠, 观察小鼠血糖及一般状况的变化.

结果: ES-D3诱导生成的IPCs在培养基中自我组装形成三维立体细胞簇, 可被DTZ染成洋红色. 诱导生成的IPCs经两次移植给DM小鼠后5 d, 受鼠的血糖水平显著降低, 一般状况有所改善, 但小鼠的血糖未能降至正常水平; 第2次移植后15 d, 血糖水平反弹到与移植前没有差别.

结论: ES-D3诱导生成的IPCs皮下移植给DM小鼠, 能在一段时间内显著降低受鼠的血糖水平, 改善一般状况, 对DM小鼠起到一定的治疗作用.

关键词: N/A
引文著录: 刘星霞, 缪兵, 李府, 马秀峰, 时庆, 沈柏均. 胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞移植对糖尿病鼠的治疗作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(8): 1853-1856
Therapeutic effect of insulin-producing cells induced from embryonic stem cells on diabetic mice
Xing-Xia Liu, Bing Miao, Fu Li, Xiu-Feng Ma, Qing Shi, Bai-Jun Shen
Xing-Xia Liu, Fu Li, Xiu-Feng Ma, Qing Shi, Bai-Jun Shen, Department of Cryomedicine, Shandong University Qilu Hospital, Jinan 250012, Shandong Province, China
Bing Miao, Department of Physiology, Shandong University School of Medicine, Jinan 250012, Shandong Province, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30271248.
Correspondence to: Dr. Bai-Jun Shen, Department of Cryomedicine, Shandong University Qilu Hospital, Jinan 250012, Shandong Province, China. shenbaijun@21cn.com
Received: February 11, 2004
Revised: February 12, 2004
Accepted: February 13, 2004
Published online: August 15, 2004

AIM: To study the therapeutic effect on diabetic mice of insulin-producing cells induced from embryonic stem cells.

METHODS: Firstly, ESCs were induced to differentiate in serum-free DMEM supplemented with bFGF for more than 3 weeks, and DTZ staining was used to identify the induced IPCs; Secondly, experimental diabetes was induced in 6- to 8-week-old male Balb/c mice by a single intraperitoneal injection (200 mg/kg) of streptozotocin freshly dissolved in 0.1 moL/L of citrate buffer, pH 4.5; Finally, the induced IPCs were harvested at day 21 after differentiation, and grafted subcutaneously in the shoulder of streptozotocin-diabetic mice to observe their glucose-reducing effect.

RESULTS: ESCs could be induced to differentiate into IPCs in serum-free DMEM supplemented with bFGF. The induced IPCs were stained crimson red by DTZ, and their transplantation could reduce blood glucose of diabetic mouse significantly.

CONCLUSION: ESCs can be induced to differentiate into IPCs in serum-free DMEM supplemented with bFGF, and the induced IPCs transplantation has a certain therapeutic effect on diabetic mice.

Key Words: N/A
0 引言

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种严重危害人类健康的疾病[1-2]. 移植胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells, IPCs)是治疗I型和部分II型糖尿病患者的有效方法, 但受限于供源缺乏. 所以, 探索移植治疗糖尿病所需的IPCs新供源迫在眉睫[3-9]. 在体外, 胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)不仅具有保持未分化状态的无限增生能力, 而且具有多向分化的潜能[10-14], 所以, 目前ESCs被视为糖尿病、老年性痴呆等多种疾病移植治疗的潜在供源[15-19]. 最近, Lumelsky et al[20]在进行鼠ESCs诱导分化研究时发现, ESCs可在体外诱导分化形成类似在体胰岛组织的胰岛素分泌结构, 为胚胎干细胞移植治疗糖尿病提供了实验依据. 我们开展了小鼠胚胎干细胞ES-D3诱导生成IPCs的研究并获得成功, 在详细研究了该IPCs的生物学特点的基础上, 我们采用链脲菌素(streptozotocin, STZ)制备的Balb/c小鼠DM模型, 进一步研究了ES-D3诱导生成的IPCs皮下移植对DM小鼠的降糖作用及对一般状况的影响, 从而探讨该IPCs皮下移植治疗DM的可能性与可行性.

1 材料和方法
1.1 材料

ES-D3细胞系购自中科院上海细胞生物化学研究所. DMEM, 胎牛血清及非必需氨基酸购自Gibco公司; Serum Replacement 3, STZ和Dithizone(DTZ)购自Sigma公司; 重组鼠碱性纤维母细胞生长因子(rm-bFGF)购自R&D System公司. Balb/c小鼠, SPF级, 由山东大学实验动物中心提供.

1.2 方法

1.2.1 取孕13 d Balb/c小鼠胚胎, 常规方法制备滋养层细胞. 所用培养基为DMEM(含高糖, 谷氨酰胺, 不含丙酮酸钠)加100 mL/L小牛血清. 临用前, 用10 mg/L丝裂霉素处理. 将复苏后的ES-D3细胞种植于原代鼠胚成纤维细胞滋养层上, 种植密度为5×108/L. 所用培养基为DMEM(含高糖, 谷氨酰胺, 不含丙酮酸钠), 添加 200 mL/L胎牛血清, 10 g/L非必需氨基酸, 0.1 mmoL/L 2-巯基乙醇(2-ME), 1 mmoL/L谷氨酰胺. 细胞培养于37 ℃, 50 mL/L CO2, 95%饱和湿度的孵箱内, 每3 d常规传代1次. 将对数生长期的保持未分化状态的ES-D3细胞用胰酶-EDTA消化后, 悬浮培养于无滋养层细胞的12孔细胞培养板. 所用诱导培养基为DMEM(含高糖, 谷氨酰胺, 不含丙酮酸钠), 添加200 mL/L serum replacement 3, 10 g/L非必需氨基酸, 0.1 mmoL/L 2-ME, 1 mmoL/L谷氨酰胺, 5 μg/L rm-bFGF. 细胞培养于37 ℃, 50 mL/L CO2, 95%饱和湿度的孵箱内, 隔天半量换液1次. 在诱导培养21 d, 由ES-D3细胞诱导生成的IPCs经DTZ染色鉴定后备用[21].

1.2.2 IPCs皮下移植对DM小鼠血糖的影响: 纯系♂Balb/c小鼠18只, 6-8周龄, 体质量202 g. 适应性饲养3 d后, 按随机表方法将小鼠随机均分为3组. 组1为IPCs移植治疗组, 组2为DM模型对照组, 组3为未进行DM造模的正常对照组. 首先用pH4.5的柠檬酸缓冲液配制4 g/L STZ溶液, 然后, 组1, 组2各鼠1次性腹腔注射STZ 200 mg/kg 以制备DM模型, 组3各鼠腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液, 作为未进行DM造模的对照组. 14 d后, 用LifeScan血糖仪检测各组小鼠的血糖水平(检测时间均为上午10: 00), 组1, 组2各鼠血糖>16.7 mmoL/L者, 诊断为糖尿病[21]. 移植采用诱导培养21 d的IPCs. 将组1各鼠行肩胛部皮下注射移植等量IPCs ((2-5)×107个细胞/ 鼠), 同时, 给组2各DM模型对照鼠及组3各未造模对照鼠皮下注射等体积不含细胞的诱导上清液作为对照, 即初次移植. 初次移植后5 d, 同样剂量的IPCs同样方法再行第2次移植. 2次移植过程中, 分别在初次移植后5 d, 第2次移植后5 d和15 d, 检测各组小鼠的血糖水平, 同时记录各鼠体质量并观察各鼠一般状况.

统计学处理 采用两样本均数比较的假设检验(方差不齐, 用t'检验), 所有数据均用mean±SD表示, α = 0.0 500(单侧).

2 结果

STZ溶液1次性腹腔注射后14 d, 检测各组小鼠的血糖水平. 组1, 组2中血糖>16.7 mmoL/L的小鼠共10只, 其余2只血糖低于标准, 分别为11.6 mmoL/L和12.1 mmoL/L. 我们把这２只小鼠从糖尿病组中分出另放. 组3各鼠血糖正常, 体质量增加(表1, 2).

表1 IPCs移植前后各组小鼠血糖水平(mean±SD, mmoL/L).
分组n血糖1 (制模前)血糖2 (制模后 移植前)血糖3 (初次移植后5 d)血糖4 (再次移植后5 d)血糖5 (再次移植后15 d)
IPCs移植组56.2±0.520.9±2.1a21.9±2.316.9±0.6c21.5±2.8
DM模型对照组56.3±0.419.5±2.5a22.1±2.921.2±2.321.5±2.1
未造模对照组66.3±0.56.4±0.97.3±0.67.1±0.86.8±1.0
aP<0.05 vs 制模前,
cP<0.05 vs 移植组移植前.
表2 IPCs移植前后各组小鼠体质量情况(mean±SD, g).
分组n体质量1 (制模前)体质量2 (制模后移植前)体质量3 (再次移植后15 d)
IPCs移植组520.3±2.518.3±2.519.8±3.2
DM模型对照组519.2±2.916.9±2.617.1±2.6
未造模对照组619.4±1.821.7±2.123.5±2.5
2.1 小鼠血糖水平的变化

STZ制模前, 各组小鼠血糖水平无差异(血糖1). 血糖2为STZ溶液腹腔注射后14 d(即IPCs移植前)的各组小鼠血糖水平; 血糖3示IPCs初次移植后5 d的各组小鼠血糖水平. 血糖4, 5分别为IPCs再次移植后5 d(即初次移植后10 d)和再次移植后15 d(即初次移植后20 d)的各组小鼠血糖水平. 结果显示, 移植前与制模前相比, IPCs移植组及DM模型对照组小鼠血糖水平均明显增高(P<0.05); 未造模对照组无明显变化, 说明模型制备成功; 初次移植后5 d, IPCs移植组血糖水平较移植前无明显改变, 说明初次IPCs移植并未起到降糖作用; 初次移植后10 d(即再次移植后5 d)与移植前相比, IPCs移植组血糖水平明显降低(P<0.05), 说明IPCs第2次移植, 可有效降低受鼠血糖; 初次移植后20 d(即再次移植后15 d), IPCs移植组血糖水平反弹至与移植前的血糖水平无明显差别. DM模型对照组和未造模对照组小鼠血糖水平始终均无明显改变, 且前组一直维持在高水平, 而后组一直维持在正常水平, 该结果说明, 第1次IPCs移植未起降糖作用, 第2次IPCs移植在一段时间内明显降低DM小鼠的血糖(表1).

2.2 小鼠体质量的变化

STZ制模前, 称量各组小鼠体质量(体质量1); STZ溶液腹腔注射后14 d(即制模后、IPCs移植前), 称量各组小鼠体质量(体质量2); IPCs第2次移植后15 d, 称量各组小鼠体质量(体质量3). 结果显示, 与制模前相比, IPCs移植组和DM模型对照组各鼠在制模后, 体质量均降低, 但无显著差异, 同时, 小鼠活动减少, 毛发疏松无光泽. 移植组小鼠在IPCs再次移植后15 d, 体质量虽无明显回升, 但动物的一般状况有所改善; 而DM模型对照组各鼠体质量继续维持较轻水平, 一般状况也较差; 未造模对照组各鼠体质量则持续增加, 且一般状况良好. 这与Lumelsky et al[2] 报道相一致(表2).

3 讨论

ESCs诱导分化为IPCs的研究起步较晚, 相关报道不多[20-26], 尤其是关于诱导生成的IPCs移植治疗糖尿病的文献则更少[20,22,24-25]. 所以, 我们在ES-D3诱导生成的IPCs获得成功并详细研究了该IPCs的生物学特点的基础上, 进一步研究了ES-D3诱生的IPCs皮下移植对DM小鼠的降糖作用及对一般状况的影响. Soria et al[22] 报告进行脾脏内IPCs移植, 能够将DM小鼠血糖水平降至正常, 并维持10 wk左右, 然后, 约一半受鼠血糖反弹至移植前水平, 原因不明. Hori et al[24] 进行肾脏被膜下移植, 能够将DM小鼠血糖水平降至<17 mmoL/L左右, 并维持约14 d, 之后, 受鼠的血糖水平反弹至移植前水平, 原因亦不明, 血糖虽未能降至正常水平, 但是, 移植受鼠的一般状况得到改善; Blyszczuk et al[25] 进行脾脏内及肾脏被膜下移植, 能够将DM小鼠血糖水平降至<10mmoL/L, 并维持约14 d, 所以, 脾脏、肾脏内移植效果较为肯定. Lumelsky et al[20] 进行了IPCs皮下移植, 结果与Hori et al[24] 的相仿, 未能纠正受鼠的高血糖, 但是, 他们观察到受鼠的一般状况得到改善, 体质量不减, 原因也不清楚. 我们考虑到临床应用及患者的接受程度, 认为皮下移植治疗有较大的实用价值. 我们分析皮下移植疗效不肯定的原因, 可能与移植IPCs的年轻程度、功能状态、细胞数量、移植局部微环境、受者病情的严重程度及个体差异等多种因素有关.

ESCs在体外不仅能诱导生成包括β细胞在内的胰腺内分泌细胞, 同时亦能分化出多种胰腺外分泌细胞, 而且ESCs诱导生成的IPCs未经纯化移植给糖尿病小鼠后, 植入的移植物在受鼠体内可形成包括β, α, δ及pp细胞在内的类胰岛组织[20,26]; 且β细胞必须移植入体内才能获得完全的功能性成熟[27-30]. 所以, 我们认为, 我们的诱导体系中, 可能存在有利于维持已诱导生成的胰腺β细胞活性和生存的其他类型的细胞或物质. 移植物中其他类型的细胞(包括胰岛的其他内分泌细胞及胰腺外分泌部的细胞等)的存在, 可能改善了移植局部的微环境, 更有利于β细胞的功能性成熟及植入的β细胞发挥作用, 因此, 我们选择胰岛素分泌处于高峰期的未纯化IPCs进行皮下移植.

就糖尿病模型而言, 目前有两种, 一是Soria et al[22] 的报道, 采用STZ(200 mg/kg)腹腔注射14 d, 受鼠的血糖水平>28 mmoL/L为诊断指标的DM模型, 二是Blyszczuk et al[25] 的报道, 采用STZ(200 mg/kg)腹腔注射后24 h, 受鼠的血糖水平约为12 mmoL/L为诊断指标的DM模型. 根据临床实际, 患者多数病程较长, 血糖水平较高, 所以我们选择采用STZ(200 mg/kg)腹腔注射14 d的受鼠作为糖尿病模型; 针对糖尿病的诊断指标, 我们根据Lumelsky et al[20] 的报道, 采用血糖>16.7 mmoL/L作为糖尿病的诊断标准. 移植细胞的数量一般为(1-2)×107个细胞/鼠[20,25], 鉴于皮下注射降糖作用较弱, 我们选择5×107个细胞/鼠进行移植. 结果, 在移植后5 d, 血糖水平未降, 我们怀疑移植细胞的数量不够, 接着进行了等量诱生的IPCs再次移植. 于第2次移植后的5 d, 发现小鼠血糖虽然未降至正常水平, 但较移植前显著降低(P<0.05, 表1). 说明在我们的实验条件下, IPCs皮下移植虽然不能将模型鼠的高血糖水平降至正常, 但在一段时间内, 能够明显降低患鼠的血糖水平.

值得注意的是, 在诱导DM模型的12只小鼠中, 有2只小鼠血糖水平分别为11.6 mmoL/L和12.1 mmoL/L, 虽然明显高于未造模对照组(6.3±0.5 mmoL/L), 但低于16.7 mmoL/L的诊断标准, 我们把这两只小鼠从糖尿病组中分出, 同时也对他们进行了IPCs移植, 移植方案同前. 结果发现, 初次移植后5 d, 这两只小鼠血糖分别恢复到6.6 mmoL/L和7.8 mmoL/L, 再次移植后5 d, 血糖仍维持在正常水平. 提示处于胰腺β细胞病损较轻的早期糖尿病的状态, 进行IPCs移植治疗, 疗效可能更好. 另外, 对于重症糖尿病患者, 先利用其他降糖药, 将血糖水平降低到一定程度, 再行IPCs移植, 或IPCs移植治疗的同时辅以其他降糖药, 疗效是否会更好, 也值得探讨.

编辑: N/A

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