幽门螺杆菌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-08-15; 12(8): 1823-1826
在线出版日期: 2004-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i8.1823
慢性胆囊炎患者胆囊内Helicobacter pylori 的细菌学特征
陈东风, 胡辂, 易萍, 刘为纹, 房殿春, 曹红
陈东风, 胡辂, 易萍, 刘为纹, 房殿春, 曹红, 中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科 重庆市 400042
陈东风, 男, 1964-01-01, 重庆市人, 汉族, 1999年第三军医大学医学博士, 副教授, 副主任医师, 硕士生导师, 主要从事胆囊疾病及脂肪肝的研究, 已发表论文47篇, 主篇医学专著1部, 参编专著8部.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 39970039.
通讯作者: 陈东风, 400042, 重庆市渝中区大坪长江支路10号, 中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科. dfchen9@hotmail.com.cn
电话: 023-68757342 传真: 023-68813806
收稿日期: 2003-10-09
修回日期: 2003-11-20
接受日期: 2003-12-08
在线出版日期: 2004-08-15

目的: 探讨慢性胆囊炎患者胆囊内幽门螺杆菌(H. pylori)的细菌学特征.

方法: 采集手术切除的病理确诊为慢性胆囊炎的新鲜胆囊标本黏膜刮片, 接种于H. pylori培养板, 培养及鉴定后与胃中分离的菌株进行形态学、生化反应、免疫组化、PCR扩增、电镜观察等方面比较.

结果: 分离出3株细菌, 经形态学观察、生化反应、抗H. pylori抗体免疫组化染色, H. pylori尿素酶A、B基因扩增及电镜观察证明他们是H. pylori, 与同一患者胃内H. pylori比较, 除胆囊内H. pylori尿素酶活性低于胃内H. pylori外, 其他性质均相同.

结论: 推测胆囊内H. pylori可能主要是通过胆道逆行感染进入胆囊.

关键词: N/A
引文著录: 陈东风, 胡辂, 易萍, 刘为纹, 房殿春, 曹红. 慢性胆囊炎患者胆囊内Helicobacter pylori 的细菌学特征. 世界华人消化杂志 2004; 12(8): 1823-1826
Characteristics of Helicobacter pylori from gallbladder mucosal scrapings in patients with chronic cholecystitis
Dong-Feng Chen, Lu Hu, Ping Yi, Wei-Wen Liu, Dian-Chun Fang, Hong Cao
Dong-Feng Chen, Lu Hu, Ping Yi, Wei-Wen Liu, Dian-Chun Fang, Hong Cao, Department of Gastroenterology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
Supported by: the National Natural Science Fundation of China, No. 39970039.
Correspondence to: Dr. Dong-Feng Chen, Department of Gastroenter-ology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042,China. dfchen9@hotmail.com.cn
Received: October 9, 2003
Revised: November 20, 2003
Accepted: December 8, 2003
Published online: August 15, 2004

AIM: To study the characteristics of Helicobacter pylori (H. pylori) isolated from gallbladder mucosal scrapings in patients with chronic cholecystitis.

METHODS: H. pylori -like bacteria isolated from gallbladder mucosal scrapings and stomach in 81 patients with chronic cholecystitis were identified as H. pylori. The amplification bands were observed by PCR method using the H. pylori -specific primers, HPUA, and HPUB. Ultrastructural characteristics were also examined with transmission electron microscope.

RESULTS: The urease activity of H. pylori derived from cholecyst was lower than that from the patients' stomach. The other characteristics were the same in both cholecystic H. pylori and gastric H. pylori.

CONCLUSION: It is most likely that H. pylori excretes from the stomach into the duodenum and then is retrogradely transferred to the gallbladder by the ascending routes of infection.

Key Words: N/A
0 引言

幽门螺杆菌(Helicobater pylori, H. pylori)的研究已引起广泛关注[1-14], H. pylori 与某些肝胆疾病有关[15-20] , 我们研究表明部分慢性胆囊炎患者胆囊内也有H. pylori存在, 这些H. pylori在胆囊内是活菌还是死菌? 他们的细菌学特征怎样? 是否在胆囊有H. pylori感染的患者胃内也有H. pylori感染? 他们之间在形态特征上有什么异同? 我们采用细菌分离培养技术、生化实验、PCR技术、免疫组化及电镜观察, 并进行体外药敏试验, 以期了解胆囊内H. pylori的特征.

1 材料和方法
1.1 材料

慢性结石性胆囊炎行胆囊切除术的患者81例, 收集手术切除之胆囊标本, 其中有44例在术前曾行胃镜检查, 留取距幽门2-3 cm处胃窦黏膜标本.

1.2 方法

胆囊H. pylori采用改良选择性布氏羊血培养基巧克力平板进行培养, 将标本置于无菌饭盒内, 迅速移至实验室超净台 (SW-CJ-2FD型, 苏州安泰空气技术公司)内, 无菌条件下剪开胆囊弃去胆汁及结石, 无菌纱布蘸干, 刀片擦刮黏膜, 取黏液于H. pylori培养板中; 然后取米粒大小胆囊黏膜数块, 置于玻璃组织匀浆器中, 匀浆后涂于H. pylori培养板, 划线接种, 将接种的平板置于培养缸内, 保持95%湿度, 经抽气-换气, 使缸内达到50 mL/L的氧, 制成微需氧环境, 37 ℃, 培养3-5 d; H. pylori的鉴定按以下步骤进行: 细菌涂片Gram染色镜检, 用尿素酶、触酶、氧化酶、H2S产生、硝酸盐还原试验、马尿酸水解实验, 按细菌学常规进行生化反应, 对细菌涂片用抗H. pylori抗体行免疫组化染色, 加入尿素酶A, B基因特异引物PCR扩增. 对培养的细菌行电镜观察: 培养阳性细菌用生理盐水从平皿中洗下后收集于试管中、加入少许牛血清白蛋白4 ℃离心(4 000 r/min×5 min), 弃去液体、然后缓慢加入30 mL/L戊二醛固定经离心沉淀的菌团, 丙酮逐级脱水树脂包埋, LBK型切片机作超薄切片(切片厚度为50 nm)、醋酸铀及棕檬酸铅双染色后, 用透射电镜观察、摄片. 选用公认的H. pylori体外药敏常用药物浓度, 当培养基冷至50 ℃时加入羟氨苄青霉素 (0.01 mg/L)(重庆药友制药公司), 甲硝唑(20 mg/L) (重庆制药七厂), 先锋霉素V(l0 mg/L)(西南药业股份有限公司), 丽珠得乐冲剂(20 mg/L) (珠海丽珠制药厂), 然后将培养的细菌, 用布氏肉汤稀释至5×1011CFU/L, 721分光光度计, 1 A660约相当于1×1011CFU/L, 吸取稀释的菌液200 μL, 滴加在平板上, 均匀涂布, 然后行微需氧培养, 3 d后, 从药敏平板上用菌环盲刮转至无抗生素培养板, 再培养3 d, 无菌生长者为敏感, 否则为耐药. 胃镜检查44例, 将其胃黏膜进行H. pylori培养、鉴定、药敏试验, 整个步骤及内容同胆囊标本处理一致; 并对同一患者胆囊和胃中分离出的H. pylori进行形态学、生化反应、组化染色、PCR扩增、电镜观察等方面的比较.

统计学处理 计数资料用x2检验, P<0.05有显著性差异.

2 结果
2.1 胆囊H. pylori的特征

用选择性布氏羊血巧克力平板, 微需氧培养, 从胆囊炎患者胆囊黏膜刮片和匀浆中分离培养出3株H. pylori, 其菌落特点是在培养3-5 d后, 可见圆形、孤立小菌落, 直径约l mm, 无色半透明(注意在不同光线平面观察), 在许多平板上, 常有数种细菌生长, 将不同菌落转种培养, 然后进行鉴定, 对那些菌落形态类似于H. pylori的菌落及时转种, 进行相应实验; 转种后3-5 d, 细菌菌落可连成片, 最后变得平坦, 生长能力下降, 再次转种则生长变差, 乃至不生长, 对培养所得细菌涂片Gram染色镜检, 镜下可见分离出的H. pylori为G染色阴性, 呈棒弯状、弯杆状、弧形、螺旋形、弯曲形、S型、U型, 其大小约0.5- 0.7 μm×2-3 μm, 长短不尽一致, 但仍属H. pylori细菌变化范围, 培养超过7 d或转种后超过5 d, 该菌则渐变短, 呈短棒状或近似球形, 着色变浅, 取纯培养菌作悬滴观察, 该菌运动活跃, 培养时间较久的细菌, 运动能力明显下降; 其生化反应是细菌尿素酶、触酶、氧化酶均阳性, 碱性磷酸酶、谷胺酰转肽酶也阳性, 但该菌无还原硝酸盐、水解马尿酸和利用糖类的能力、H2S试验阴性; 抗H. pylori抗体免疫组化染色后镜下观察: 细菌染成棕黑色、菌体部分着色较深, 未见鞭毛染色, 细菌形态有典型的S形、螺旋形、螺杆形, 也有呈杆状、弧形状、弯曲状形态(图1); 长时期培养的变成球形的细菌也呈阳性着色反应, 应用本抗体对空肠弯曲菌及变形杆菌进行免疫组化染色, 未见抗H. pylori阳性染色细菌出现; 电镜观察: 该菌呈不规则弯曲形、有典型S及螺杆形, 也有呈杆弯形, 宽约0.5-0.7 μm, 长约2.0-3.0 μm, 菌体表面光滑, 两端钝圆, 有明显的细胞壁, 有的菌体细胞壁外可见边缘不规则的外被, 部分细菌一端隐约可见鞭毛(图2). 尿素酶A, B基因PCR扩增 胆囊中分离培养所得的3株细菌, 用PCR扩增, 其中2株HPUA和HPUB都有阳性扩增带, 1株仅HPUA阳性, 用产尿素酶的变形杆菌(大坪医院细菌室提供)进行PCR扩增, HPUA, HPUB皆无阳性扩增带. 体外药敏试验: 有2株对羟氨苄青霉素、甲硝唑、先锋霉素V及铋剂敏感, 1株对甲硝唑耐药, 但对羟氨苄青霉素、先锋霉素V及铋剂敏感.

图1
图1 胆囊内幽门螺杆菌培养, 抗幽门螺杆菌抗体染色阳性 SP×200.
图2
图2 胆囊内幽门螺杆菌培养电镜图像, 形态呈典型螺旋杆菌形×10 000.
2.2 胃H. pylori的特征

胃镜检查44例, 发现20例有胆汁反流, 胃溃疡3例, 十二指肠球部溃疡4例, 慢性胃炎37例; 对这44例患者进行了快速尿素酶试验及前述的一系列的检查发现, PCR阳性率(28/44, 63.6%)显著高于细菌培养阳性率(17/44, 38.6%) (P<0.01), 而快速尿素酶试验(21/44, 47.7%), W-S染色(24/44, 54.5%)、免疫组化(25/44, 56.8%)对H. pylori诊断率相近似, H. pylori培养法阳性率最低(38.6%), 但更可靠, 是公认的判断H. pylori感染的金标准. 药敏试验结果: 从胃内分离出的17株H. pylori有5株对甲硝唑耐药, 有1株对羟氨苄青霉素耐药, 3例从胆囊内分离出H. pylori的患者, 胃内皆有H. pylori感染.

2.3 胆囊和胃内H. pylori的比较

胆囊内分离出的3株H. pylori从形态上与这3例患者胃内的H. pylori基本相似, 但在尿素酶活性观察中, 即将同量的H. pylori置入尿素酶试管内, 从胆囊内分离出的H. pylori呈现阳性反应速度慢于从胃内分离的H. pylori; 胆囊内分离出的H. pylori有一株仅HPUA阳性, 而这3例患者胃内H. pylori的HPUA和HPUB皆阳性, 3株从胆囊中分离出的H. pylori有一株对甲硝唑耐药, 同一患者胃内的H. pylori对甲硝唑也耐药.

3 讨论

慢性胆囊炎是临床常见病和多发病, 其中以慢性结石性胆囊炎为多[21], 约占慢性胆囊炎的85%, 胆囊结石患者并发胆囊炎的机制较为复杂, 大多数慢性胆囊炎都与细菌感染有关[22-27], 但尚有10%-30%胆汁内细菌未能确定. 在慢性胆囊炎患者切除之胆囊中用W-S银染, 抗H. pylori抗体及PCR扩增证实该胆囊炎患者为H. pylori感染所致, 研究发现H. pylori确与许多肝胆疾病有关[28]; 我们从81例慢性结石性胆囊炎患者经手术切除胆囊标本黏膜刮片或匀浆中所分离培养出的细菌中有3株细菌类似H. pylori, 根据其菌落特点, 形态特征, 免疫组化染色及PCR扩增和电镜观察, 其特点符合H. pylori; 事实上, H. pylori要在胆囊内存活, 他必须能耐受胆汁, 我们的资料提示胆囊炎患者伴有十二指肠胆汁反流的机会较多, 然而此类患者胃内H. pylori感染率无明显下降, 提示这些患者胃内的H. pylori可能对胆汁有一定耐受, 或本身发生某些变异能够抵抗一定浓度胆盐的影响及损伤; 有学者认为H. pylori可以通过胃进入到十二指肠, 在美克尔憩室黏膜上证实有H. pylori, 且能从人粪便中分离培养出H. pylori, 这些事实都证明至少某些H. pylori有耐胆盐及肠液的能力[29-30]; 胆石症患者可以出现胃肠运动功能失调及胆囊、胆道及Oddi 扩约肌功能紊乱及协调性下降和排空障碍[31-33], 这样, 那些能耐受胆盐的H. pylori经过公认的逆行感染 (ascending infection)途径进入胆囊, 加之胆石症时胆囊内胆汁浓度常有下降, 这更为H. pylori在胆囊内存活提供了条件, 这样H. pylori便能在胆囊内存活, 进一步定植于胆囊黏液层或/和胆囊黏膜上皮细胞表面, 因此, 我们认为胆囊内的H. pylori可能是从胃内进入十二指肠后逆行感染而来; 本研究还发现胆囊内能分离出 H. pylori的患者, 其胃内也都有H. pylori感染, 且经形态观察, 免疫组化, PCR扩增, 电镜观察同一患者胆囊和胃内的H. pylori基本相似, 但也有不完全相同之处, 如胆囊内H. pylori尿素酶活性低于胃内H. pylori, 这可能与胆囊内本身是碱性环境, 胆囊黏膜分泌偏碱性物质有关, 因此, 不象H. pylori在胃内明显酸性环境中需要分泌大量的尿素酶分解尿素, 形成局部碱性环境, 以利于自己生存和定植; 胆囊内的H. pylori可能出现尿素酶基因结构的变异, 有研究报道对胆汁内经PCR扩增的HPUA进行测序发现H. pylori尿素酶A基因出现了点突变, AAA→AGA, 即164位 lys→Arg, 尿素酶基因的这种适应性变化, 一方面可能使胆囊内H. pylori尿素酶产量和活性下降, 同时也可能会出现用HPUA或HPUB特异引物进行扩增时所出现的单一HPUA或HPUB阳性, 即在同一标本HPUA和HPUB不同时出现阳性, 这便可能解释我们所研究的81例标本中尿素酶基因扩增结果; 有22例本组患者胆囊PCR扩增阳性, 而用细菌分离培养方法只分离培养出3株H. pylori, 这可能是胆囊内虽有H. pylori的DNA, 但细菌已死亡, 或活的H. pylori数量较小, 或取材不够等所致; 从胆囊中分离培养出的3株H. pylori与该三患者胃内分离出的H. pylori在基因结构上是否有差异, 尚需对所分离的H. pylori 16sRNA测序分析进一步研究鉴定.

编辑: N/A

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