幽门螺杆菌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-08-15; 12(8): 1814-1817
在线出版日期: 2004-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i8.1814
人胆囊炎标本中幽门螺杆菌的检出及意义
陈东风, 胡辂, 易萍, 刘为纹, 房殿春, 曹红
陈东风, 胡辂, 易萍, 刘为纹, 房殿春, 曹红, 中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科 重庆市 400042
陈东风, 男, 1964-01-01, 重庆市人, 汉族, 1999年第三军医大学医学博士, 副教授, 副主任医师, 硕士生导师, 主要从事胆囊相关疾病及脂肪肝发病机制及防治的研究, 已发表论文47篇, 主篇医学专著1部, 参编专著8部.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 39970039.
通讯作者: 陈东风, 400042, 重庆市渝中区大坪长江支路10号, 中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科. dfchen9 @hotmail. com.cn
电话: 023-68757342 传真: 023-68813806
收稿日期: 2003-10-09
修回日期: 2003-10-20
接受日期: 2003-11-06
在线出版日期: 2004-08-15

目的: 探讨慢性胆囊炎患者胆囊内是否存在幽门螺杆菌(H. pylori).

方法: 对手术切除的病理确诊为慢性胆囊炎的胆囊石蜡标本用W-S银染色法筛选和抗H. pylori抗体进行免疫组化染色, 对手术切除标本胆囊黏膜DNA用H. pylori尿素酶A, B基因引物行PCR扩增, 研究慢性胆囊炎胆囊中H. pylori 感染的情况.

结果: 524例胆囊炎手术标本蜡块中有71例(13.55%)镜下观察到类似H. pylori的细菌, 其中37例(7.1%)有H. pylori抗体染色阳性细菌, 81例慢性胆囊炎手术后新鲜标本胆囊黏膜DNA PCR扩增, 11例(13.6%)尿素酶A、B基因皆阳性, 4例仅有尿素酶A基因阳性, 7例仅有尿素酶B基因阳性.

结论: 部分慢性胆囊炎患者胆囊内确有H. pylori 存在.

关键词: N/A
引文著录: 陈东风, 胡辂, 易萍, 刘为纹, 房殿春, 曹红. 人胆囊炎标本中幽门螺杆菌的检出及意义. 世界华人消化杂志 2004; 12(8): 1814-1817
Detection of Helicobacter pylori from gallbladder mucosa in patients with chronic cholecystitis
Dong-Feng Chen, Lu Hu, Ping Yi, Wei-Wen Liu, Dian-Chun Fang, Hong Cao
Dong-Feng Chen, Lu Hu, Ping Yi, Wei-Wen Liu, Dian-Chun Fang, Hong Cao, Department of Gastroenterology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
Supported by: the National Natural Science Fundation of China, No. 39970039.
Correspondence to: Dr. Dong-Feng Chen, Department of Gastroenter-ology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China. dfchen9@hotmail.com.cn
Received: October 9, 2003
Revised: October 20, 2003
Accepted: November 6, 2003
Published online: August 15, 2004

AIM: To study whether Helicobacter pylori (H. pylori) located in gallbladders of chronic cholecystitis.

METHODS: Using Warthy-Starry (W-S) stain and immunohistochemical stain with anti-H. pylori antibody, we screened paraffin specimens in 524 cases of cholecystitis. Helicobacter pylori urease gene A (HPUA) and Helicobacter pylori urease gene B (HPUB) were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) in the fresh tissue specimens in 81 cases of cholecystitis.

RESULTS: H. pylori-like bacteria were found in 13.55% of gallbladders in cholecystitis patients using W-S stains; Meanwhile, positive bacteria for H. pylori antibody were also found in 7.1% of gallbladder in patients with cholecystitis using immunohistochemistry. Both of HPUA and HPUB were positive in 11 of 81 gallbladders by PCR, only 4 cases positive for HPUA, and 7 cases with HPUB positive.

CONCLUSION: H. pylori certainly exists in gallbladders in some patients with chronic cholecystitis.

Key Words: N/A
0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃黏膜相关淋巴组织恶性淋巴瘤(MALToma)有密切关系[1-21], 近来发现H. pylori与胃、十二指肠以外的其他器官的某些疾病也有一定的关系[22-26], H. pylori与邻近胃、十二指肠并通过胆管相互沟通的胆囊是否有关联, 目前尚不清楚. 我们对慢性结石性胆囊炎患者胃内H. pylori检出率比较及手术标本用Warthin-Starry(W-S)染色, 免疫组化及PCR方法试图证明胆囊中存在H. pylori.

1 材料和方法
1.1 材料

我院1995年以来住院手术病理证实为慢性胆囊炎, 且住院期间接受过胃镜检查及H. pylori快速尿素酶试验的患者142例, 与同期随机抽取的因消化道症状行胃镜检查的患者(己除外胆囊疾病)作为对照组进行比较分析, 确定胆囊炎患者胆汁反流及胃内H. pylori检出率是否与对照组有差别; 1995年以来手术病理证实的慢性胆囊炎胆囊石蜡块切片524例, 行W-S染色, 观察螺杆菌样细菌是否存在; 我院1999-07/2000-07因胆石症、慢性胆囊炎行胆囊切除的患者81例新鲜胆囊标本抽提DNA, 行PCR扩增.

1.2 方法

将524例胆囊炎标本石蜡块4 μm切片, 采用W-S银染色, D.P.X封片, 光镜下观察是否有螺杆菌样细菌存在; H. pylori免疫组化染色采用链菌素亲生物素一过氧化物酶连接法(SP法), 抗H. pylori抗体为Dako公司产品, 稀释度为1: 10, 以PBS替代一抗作为空白对照, 正常血清替代一抗作为阴性对照, 用H. pylori阳性的胃黏膜切片作阳性对照. H. pylori尿素酶基因A, B PCR扩增: 81例胆囊标本留取胆囊体底部置于预先处理的玻璃瓶中, 提取胆囊黏膜DNA, -20 ℃冻存待用. PCR方法扩增步骤是: (1)引物合成 HPUA1和HPUA2是根据尿素酶A基因的核苷酸304-714段设计的引物, 扩增片断为41l bp, HPUB1和HPUB2是根据尿素酶B基因核酸1 971-2 102段设计的引物, 扩增片断为132 bp, 此两对引物具有高度特异性, 引物序列分别为: HPUA1: 5'-GCCAATGGTAAATTAGTT-3'; HPUA2: 5'-CTCCTTAATTGTTTAC-3'; HPUB1: 5'-TGGGATTAGCGAGTATGT-3'; HPUB2: 5'-CCCATTTGACTCAATG-3', 上述引物由上海生工生物工程公司合成; (2)反应体系及参数见文献(实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 成都: 四川科学技术出版社, 1994: 496-498); (3)PCR扩增产物凝胶电泳分析于紫外灯观察, 并与Marker比较.

统计学处理 所得的数据皆为计数资料, 进行x2检验, P<0.05为差异显著.

2 结果
2.1 慢性胆囊炎患者胃内H. pylori

慢性胆囊炎患者142例, 胃镜检查发现胃溃疡13例, 球部溃疡8例, 慢性胃炎121例, 其中有胆汁反流者76例; 对照组为随机抽取的同期因消化道症状接受胃镜检查且排除胆囊疾患者123例, 其中胃溃疡6例, 球部溃疡7例, 胃癌2例, 慢性胃炎108例, 对照组中有胆汁反流者36例; 二组胃内H. pylori检出率(61/123 vs 81/142)相似, 但胆囊炎组胆汁反流检出率较对照组显著增高(36/123 vs 76/142, P<0.01, 表1). 慢性胆囊炎有胆汁反流患者胃内H. pylori检出率与对照组中有胆汁反流H. pylori检出率无显著差异(16/36 vs 35/76, P>0.05).

表1 两组患者胃镜检查结果.
分组n胆汁反流
球部溃疡
胃溃疡
H. pylori (+)
n%n%n%n%
对照组1233629.375.764.96149.6
慢性胆囊炎组14276b53.585.613b9.28157.0
bP<0.01 vs 对照组.
2.2 胆囊炎存档蜡块W-S银染色

作为阳性对照的胃黏膜标本, W-S染色后光镜下可见胃黏膜上皮细胞表面有弯曲状、弧形、螺旋状的黑褐色细菌, 与染成黄色的胃黏膜组织反差明显. 在全部524例胆囊炎手术标本蜡块中, W-S银染后, 71例(13.6%)镜下可观察到类似于H. pylori的细菌; 这些细菌形态呈弧形、杆状、弯曲状及螺旋形等, 也有的呈梭形, 甚至见个别呈球形的阳性染色细菌, 有34例标本除发现有银染色阳性H. pylori样细菌外, 背景中尚能见到有其他细菌存在(图1).

图1
图1 胆囊黏膜表面黏液中弯曲状银染阳性细菌WS×200.
2.3 抗Hp抗体免疫组化观察

将银染阳性的有H. pylori样细菌的71例标本, 用抗H. pylori抗体作免疫组化染色, 镜下观察发现仅37例(52.1%)有H. pylori抗体染色阳性细菌, 即在524例胆囊炎手术标本蜡块中7.1%(37/524)有H. pylori抗体染色阳性细菌; 镜下观察H. pylori抗体阳性细菌呈棕黑色, 染色主要集中在菌体周围, 细菌形态可分为弯曲状、弯杆状及螺旋状, 位于胆囊黏膜上皮细胞表面, 黏膜腺腔内, 这些细菌有的散在、有的呈团簇状分布(图2).

图2
图2 胆囊黏膜表面黏液中H. pylori抗体染色阳性细菌SP×200.
2.4 H. pylori尿素酶A, B基因PCR扩增

在81例胆囊标本中, 11例(13.6%)HPUA和HPUB皆有阳性扩增带; 单有HPUA阳性者4例; 单有HPUB阳性者7例, 因此共有22例(27.2%)出现了H. pylori尿素酶A或B基因PCR阳性扩增带; 而在6例阳性对照胃黏膜标本中, 两对引物均有阳性扩增带(图3, 4).

图3
图3 胆囊黏膜DNA HPUB引物PCR扩增, 示132 bp阳性扩增带.
图4
图4 胆囊黏膜DNA HPUA引物PCR扩增, 示411 bp阳性扩增带.
3 讨论

我们通过对慢性胆囊炎患者胃镜检查发现其胃内胆汁反流率明显高于对照组, 提示该类患者容易出现胆汁反流, 慢性结石性胆囊炎患者80%可出现胆汁反流, 而普通人群只有32%存在胆汁反流[27-28]. H. pylori对胆盐敏感, 尤其是非结合胆盐对H. pylori更具毒性, 他们认为H. pylori不能在有胆盐存在的环境中生存[29]. 我们发现, 慢性结石性胆囊炎伴胆汁反流的患者胃内H. pylori不仅存在, 而且其检出率为46.1%(35/76), 还稍高于无反流者的44.4%(16/36), 提示这类患者胃内有较高的H. pylori感染率, 尽管有胆汁反流存在, 并不减少胃内的H. pylori感染, 这与Caldwell et al[28]研究结果相似; 他们研究了慢性结石性胆囊炎患者行胆囊切除术前后胃炎及H. pylori感染程度, 结果显示胆囊切除后十二指肠胃反流明显, 胃炎加重, 同时胃内H. pylori感染率由术前的32%反而升至术后的68%, 差异显著(P<0.05), 他们认为H. pylori能在碱性环境中存活, 并可加重胃炎的程度. 我们的资料提示慢性结石性胆囊炎患者容易出现胆汁反流, 但胃内H. pylori感染率仍较高, 胃内可能存在一类能抵抗胆盐的H. pylori, 胆汁反流可能对H. pylori起到一个选择作用, 使那些能耐胆盐的H. pylori被筛选存活下来, 并与胆汁一道相互协同, 加重对胃黏膜的损伤[30], 这样, 那些能耐受胆盐可在碱性环境下生存的H. pylori就有可能通过共同通道, 经逆行感染途径进入胆囊.

本组524例慢性胆囊炎标本71例有W-S银染阳性细菌, 再用H. pylori抗体免疫组化染色仅有37例阳性, 这进一步说明用W-S染色在胆囊标本中寻找H. pylori, 只宜作为初筛方法. 本组慢性结石性胆囊炎中经H. pylori抗体免疫组化证实的H. pylori感染率为7.1%(37/524), 处于较低水平; H. pylori主要存在于胆囊黏膜上皮细胞表面及黏液层中, 偶见于细胞间, 也可见于黏液腺内. 细菌形态为H. pylori常见的螺旋形、U形、S形, 多数呈散在分布, 也有成簇的现象, 这些表现都与胃内的H. pylori相似.

对81例慢性胆囊炎行手术切除的新鲜标本用HPUA和HPUB特异性引物PCR扩增共有27.2%(22/81)出现阳性扩增带, 明显高于经W-S银 染色筛选的阳性率(13.6%)及用H. pylori抗体免疫组化染色的阳性率(7.1%), 可能是因为PCR扩增的模板DNA是由约0.5 cm×0.5 cm的胆囊黏膜组织抽提而来, 其获得H. pylori DNA的量大有关, 加之PCR可以检测出10-100个H. pylori, 敏感程度高, 故用PCR方法检测胆囊标本H. pylori, 检出率就较高; 另外, 因PCR是检测H. pylori的DNA, 因此, 在许多情况下, 只要胆囊黏膜内有H. pylori DNA则可出现阳性扩增带, 这些H. pylori可能是死亡的H. pylori, 也可能是以前感染残存的H. pylori, 从而导致PCR出现阳性扩增带. 本组PCR扩增阳性的标本中, 有11例HPUA和HPUB二者皆阳性, 而对照组6例确诊H. pylori感染的胃黏膜标本全部为HPUA和HPUB同时阳性, 因此, 胆囊内有H. pylori 存在应肯定无疑; 至于出现单一HPUA或HPUB阳性的患者是胆囊内有H. pylori存在, 还是胆囊内曾经有过H. pylori感染, 抑或某些H. pylori在胆囊内其基因结构发生了某些变化还不清楚[31]. 本研究提示胆囊内存在H. pylori, 且可能与胆囊炎的发生有关, 但仍需进一步研究证明.

编辑: N/A

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