胃癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-08-15; 12(8): 1778-1780
在线出版日期: 2004-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i8.1778
抗胃癌抗体轻链可变区序列测定和三维结构模建
杨丽娟, 白玉杰, 药立波, 闫小君, 苏成芝
杨丽娟, 中国人民解放军总医院内分泌科 北京市 100853
白玉杰, 闫小君, 中国人民解放军第四军医大学基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710032
药立波, 苏成芝, 中国人民解放军第四军医大学生物化学与分子生物学教研室 陕西省西安市 710032
杨丽娟, 女, 山西省太原市人, 1963年出生, 汉族, 1997年第四军医大学博士, 副主任医师, 副教授. 主要从事内科的基础和临床工作.
通讯作者: 杨丽娟, 100853, 北京市复兴路28号, 中国人民解放军总医院内分泌科. zw4578@vip.sina.com
电话: 010-66937425 传真: 010-68168917
收稿日期: 2004-03-15
修回日期: 2004-04-01
接受日期: 2004-04-13
在线出版日期: 2004-08-15

目的: 确定抗胃癌抗体轻链可变区(VL)的一级结构, 并模建其三级结构.

方法: 从抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出VL 基因, 并进行序列测定和分析. 利用同源蛋白结构模建技术, 采用计算机辅助分子设计系统模建VL的三维空间结构.

结果: 所获得的VL 序列符合鼠抗体可变区特征, 并成功构建了其三维空间结构.

结论: 所测得的VL一级结构和构建的三维空间结构均有较高的可靠性.

关键词: N/A
引文著录: 杨丽娟, 白玉杰, 药立波, 闫小君, 苏成芝. 抗胃癌抗体轻链可变区序列测定和三维结构模建. 世界华人消化杂志 2004; 12(8): 1778-1780
Sequencing of light chain variable region antibody against human gastric cancer and modeling of its three dimensional structure
Li-Juan Yang, Yu-Jie Bai, Li-Bo Yao, Xiao-Jun Yan, Cheng-Zhi Su
Li-Juan Yang, Department of Endocrinology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Yu-Jie Bai, Xiao-Jun Yan, Institute of Gene Diagnosis Technology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
Li-Bo Yao, Cheng-Zhi Su, Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
Correspondence to: Dr. Li-Juan Yang. Department of Endocrinology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China. zw4578@vip.sina.com
Received: March 15, 2004
Revised: April 1, 2004
Accepted: April 13, 2004
Published online: August 15, 2004

AIM: To confirm the primary structure and to model the three-dimensional structure of the light chain variable region (VL) antibody against human gastric cancer.

METHODS: The VL gene was selected from the phage display library of antibody against human gastric cancer, sequenced and analyzed. The three dimensional structure of VL was also modeled by computer homology modeling techniques.

RESULTS: The sequence of VL was in agreement with the characteristics of the mouse antibody variable region. In addition, the three dimensional structure of VL was modeled.

CONCLUSION: The primary structure and the three-dimensional structure of VL are proved reasonable and reliable.

Key Words: N/A
0 引言

胃癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤. 我们利用噬菌体抗体库技术, 绕过杂交瘤技术, 获得了鼠抗人胃癌轻链可变区片段, 为今后胃癌的显像和导向治疗奠定了一定的基础. 然而, 由于其为鼠源性, 限制了其应用. 必须先进行人源化改造, 才能更好地应用于临床. 而进行人源化设计必须了解其三维结构. 因此本研究利用同源蛋白结构模建技术, 采用MSI公司开发的计算机辅助分子设计系统模建了VL的三维结构.

1 材料和方法
1.1 材料

细菌菌株E.coli TG1, 克隆及表达载体pCANTAB5E, 扩增VL可变区基因引物及RS Primer Mix均为Pharmacia 公司产品. 其他有关分子生物学试剂系华美公司和Promega公司产品. InsightⅡ(2000)软件包为MSI公司产品.

1.2 方法

抗人胃癌单链抗体基因文库及噬菌体表面呈现文库的构建和筛选见文献[1]. 从4 ℃贮存的阳性克隆菌种取100 μL接种于25 mL含氨苄青霉素(100 mg/L)的SOC培养液中, 30 ℃振荡培养过夜, 碱裂解法大量制备噬菌粒DNA, 经FPLC Hi Trap Q柱纯化, 经EcoRI, HindⅢ双酶切鉴定后, 作为测序模板, 用S3 和S6引物从基因两端测序. 将所测得的DNA序列在Internet上进行同源性比较和氨基酸序列的推导及同源性分析. 通过www.ncbi.nem.nih/BLASTP网利用BlastP[2]软件搜索蛋白质晶体结构数据库(PDB), 获得VL的同源蛋白, 利用InsightⅡ(2000)软件, 选择homology程序包, 经过同源蛋白结构叠加以确定SCR区和Loop区, 以该同源蛋白为模板对VL的主链、侧链进行结构模建. 模建获得的VL初始结构利用Discover程序包, 应用CVFF力场, 通过最陡下降、共轭梯度、牛顿力学对初始模型进行分子力学优化及常温分子动力学动态模拟, 获得VL的三维结构的能量最低构象. 所有工作均在SGI Indigo 2工作站上完成.

2 结果
2.1 抗人胃癌VL基因序列的测定及同源性分析

用S3 和S6引物从基因两端测序, 测出的核苷酸序列. 将基因序列与基因数据库( EMBL+genbank+DDBJ)中已知的基因做同源性分析. 其同源序列均为鼠Ig Vk基因(图1), 与之同源性最高的为S61341(Score 1074).

图1
图1 VL基因序列同源性分析结果.
2.2 氨基酸序列的推导分析

VL基因长度为321 bp, 系一开放读框, 可编码107个氨基酸, 序列中有明确的4个FR区和3个CDR区, 以及抗体结构所必须的特征性两个恒定半胱氨酸残基, 表明其结构符合鼠Ig轻链可变区的氨基酸序列特征(图2).

图2
图2 VL氨基酸序列推导.
2.3 三维结构的同源模建

以VL序列为探针, 用Fasta 3程序在PDB库中搜索VL的同源蛋白. 模板蛋白为免疫球蛋白(PDB号: 1FVB), 和目标蛋白VL二者具有76.4%的序列相似性. 把1FVB和VL进行叠加, 共有 6 个SCR区, 5 个Loop区. 如图3所示. 用模板蛋白1FVB结构的C原子坐标确定了VL主链构象并完成了侧链安装, 组装出完整的VL三维结构. 对模建的VL三维结构在CVFF力场下, 经过最陡下降, 牛顿力学等方法进行能量的分子力学优化, 获得能量最低构象. 该稳定构象为全-β模式, N端5个反平行β片层, C端6个反平行β片层, N端2个高度保守的半胱氨酸残基形成1对二硫键结构. 如图4所示. 模建获得的VL空间构象与1FVB晶体结构进行主链C原子的C迭合, 迭合后的均方根位移RMS = 0.15 nm, 表明理论模建的VL空间结构是可靠的. 应用Profile-3D对优化后的VL三维结构进行理论评估. 结果显示, 模建结构中无不兼容的残基, 说明结构较合理, 而且优化后结构更合理.

图3
图3 模板蛋白1FVB和目标蛋白VL的序列比对图.
图4
图4 以1FVB晶体结构为模板同源模建获得的目标蛋白VL的三维空间结构.
3 讨论

小分子抗体具有分子小, 免疫原性弱, 穿透力强易于进入实体瘤周围的微循环, 血清和全身廓清快, 无肾脏蓄积作用, 肿瘤显像时清晰度高, 可作载体与药物、同位素、毒素等结合之优点[3], 在肿瘤的诊断和治疗方面有极高的理论和应用价值. 我们从已构建的抗人胃癌单链抗体基因文库及噬菌体表面呈现文库中筛选出了抗人胃癌VL基因, 经序列测定及同源性分析表明其结构符合鼠Ig轻链可变区的氨基酸序列特征, 为今后的基因工程改造奠定了基础.

由于其为鼠源性, 必须先进行人源化改造, 才能更好地应用于临床. 而进行人源性设计必须了解其三维结构. 人们通过对类似蛋白质空间结构的对比发现, 蛋白质的三维结构较其一级序列更为保守. 氨基酸残基序列有50%相同的蛋白质, 约有90%的C原子偏差不超过0.3 nm, 均方根偏差约0.1 nm, 氨基酸的残基替换通常发生在蛋白质表面回折区域.蛋白质主链结构, 特别是疏水中心的结构受序列变异的影响很小[4]. 因此, 用类似蛋白来预测目标蛋白的空间构象是比较可靠的. 我们利用MSI公司的Homology软件包, 同源模建了用噬菌体抗体库技术获得的抗人胃癌抗体VL结构域的三维空间结构. 经过分子力学和分子动力学优化, Profile-3D的合理性评价, 提示所获得的VL结构域的三维结构有较高的可靠性, 这为今后的进一步实验提供了依据和指导.

编辑: N/A

1.  杨 丽娟, 苏 成芝. 抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定. 第四军医大学学报. 1998;19:22-24.  [PubMed]  [DOI]
2.  Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-3402.  [PubMed]  [DOI]
3.  Colcher D, Bird R, Roselli M, Hardman KD, Johnson S, Pope S, Dodd SW, Pantoliano MW, Milenic DE, Schlom J. In vivo tumor targeting of a recombinant single-chain antigen-binding protein. J Natl Cancer Inst. 1990;82:1191-1197.  [PubMed]  [DOI]
4.  Blundell TL, Sibanda BL, Sternberg MJ, Thornton JM. Knowledge-based prediction of protein structures and the design of novel molecules. Nature. 1987;326:347-352.  [PubMed]  [DOI]