修回日期: 2004-03-25
接受日期: 2004-04-20
在线出版日期: 2004-07-15
目的: 探讨移植肠RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted 活化T细胞调节的, 正常T细胞表达和分泌的因子)的表达在小肠移植急性排斥反应中的意义, 以及他克莫司(FK506)对他的影响.
方法: 选用成年健康♂SD和Wistar大鼠进行全小肠异位移植.实验分4组, 第1组: 非手术对照组(Wistar); 第2组: 同基因移植对照组(Wistar→Wistar); 第3组: 异基因移植组(SD→Wistar); 第4组: FK506治疗组[SD→Wistar+FK506(1 mg/kg-1/d-1, im)]. 移植术后3, 5, 7 d取各组大鼠移植肠标本进行病理学检查, 并采用免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜技术对移植肠RANTES的表达进行连续定量测定.
结果: 异基因移植组大鼠的移植肠RANTES表达在术后均非常显著高于其他3个对照组(P<0.01), 其动态变化与急性排斥反应的进程呈正相关; FK506治疗组大鼠移植肠RANTES的表达明显低于未治疗组(P<0.01).
结论: RANTES阳性细胞在小肠移植急性排斥反应中发挥了重要作用, 动态检测移植肠RANTES的表达变化, 可能成为小肠移植急性排斥反应有效的诊断指标之一.
引文著录: 杨建军, 王为忠, 王春梅, 陈丹, 季刚. 大鼠小肠移植排斥反应期移植肠RANTES表达的变化. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1738-1740
Revised: March 25, 2004
Accepted: April 20, 2004
Published online: July 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(7): 1738-1740
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i7/1738.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i7.1738
同种异体移植排斥反应是影响移植物功能和存活的最大障碍, 小肠移植排斥反应的诊断与治疗尤为困难. 我们建立大鼠全小肠异位移植模型, 用免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜技术检测移植肠RANTES(regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted 活化T细胞调节的, 正常T细胞表达和分泌的因子)的表达变化, 探讨RANTES与急性排斥反应的关系, 寻求小肠移植排斥反应早期敏感的诊断指标, 为抗排斥治疗和免疫耐受诱导策略提供新途径.
选用健康成年♂SD和Wistar大鼠, 体质量约300 g(由第四军医大学实验动物中心提供), 进行全小肠异位移植. 将动物随机分为4组, 每组移植大鼠数均为18只: 第1组, 非手术对照组(Wistar); 第2组, 同基因移植对照组(Wistar→Wistar); 第3组, 异基因移植未治疗组(SD→Wistar); 第4组, 异基因移植FK506治疗组[SD→Wistar+FK506(每日1 mg/kg, 0-7 d, im)]. 于术后3, 5, 7 d每组各处死6只大鼠, 取移植肠标本用40 g/L甲醛液固定, 常规石蜡包埋, 切片, 厚3 m, 备病理及免疫荧光检查.兔抗大鼠RANTES多抗购自美国Peprotech公司, 鼠抗兔IgG-FITC购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司, 他克莫司(FK506)每支1 mL含5 mg购自爱尔兰Kerry公司.
组织病理学检查按文献[1-4]制定排斥反应的病理学诊断标准. 激光扫描共聚焦检测移植肠RANTES表达用石蜡切片常规二甲苯、梯度酒精顺序脱蜡至水, PBS冲洗, 30 mL/L正常羊血清封闭30 min, 滴加兔抗大鼠RANTES多抗, 工作浓度为1: 50, 同时设立空白对照和已知阳性对照(以非手术对照组中Wistar大鼠的小肠组织切片作为空白对照, 异基因移植肠染色阳性标本作为阳性对照), 4 ℃过夜后室温下复温30 min, PBS振洗5 min×3次, 滴加鼠抗兔IgG-FITC(1: 50), 37 ℃孵育30 min, PBS振洗5 min×3次, 缓冲甘油封片, BIO-RAD MRC-1024型激光扫描共聚焦显微镜观察, 在400倍镜下, 胞质染色呈黄绿色荧光为阳性细胞, 应用Lasersharp软件进行扫描.每张切片在400倍镜下随机选取10个视野, 对阳性细胞聚焦区进行荧光强度测定, 计算出平均每个视野阳性细胞的荧光强度值.
统计学处理 所有结果以mean±SD表示, 数据处理采用SPSS11.0统计软件包进行方差分析, P<0.05时差异有显著性.
在未给予FK506治疗的异基因移植大鼠移植组织, 术后3 d 发现肠黏膜绒毛数量减少, 轻度水肿, 绒毛高度变矮, 间质中有少量炎性细胞浸润, 符合轻度排斥的病理学诊断标准; 术后5 d肠黏膜绒毛数稀少, 黏膜上皮开始脱落, 杯状细胞和潘氏细胞数目减少, 炎性细胞浸润加重, 以淋巴和单核细胞为主, 符合中度排斥的病理学诊断标准; 术后7 d肠黏膜绒毛结构消失, 黏膜上皮完全脱落, 肠壁变薄并坏死, 杯状细胞和潘氏细胞消失, 间质中有大量炎性细胞浸润, 基层结构破坏, 血管炎性反应显著, 符合重度排斥的病理学诊断标准. FK506治疗组大鼠和同基因移植对照组大鼠在观察期内未发现明显排斥反应征象. 非手术对照组大鼠小肠每个视野RANTES表达阳性细胞的荧光强度 (13.4±2.3). 异基因移植未治疗组大鼠移植肠RANTES表达从术后3 d开始明显升高(47.3±1.8), 术后5 d持续上升(79.0±9.5), 术后7 d达高峰 (138.5±8.7), 各时间段RANTES表达均非常显著高于其他3个对照组(P<0.01), 其动态变化与排斥反应的进程呈正相关. FK506治疗组大鼠术后3 d RANTES表达(20.8±3.2), 术后5 d轻度升高(36.4±2.5), 术后7 d仍维持在同一水平, 峰值为(40.4±5.3), 明显低于未治疗组(P<0.01). 同基因移植对照组大鼠术后移植肠RANTES表达的变化趋势与治疗组相似(P>0.05, 表1).
小肠移植是治疗终末期肠功能衰竭, 如短肠综合征的惟一确切的方法[5]. 小肠移植之所以难以长期存活, 主要是因为小肠属于高免疫原性器官, 小肠及其系膜拥有丰富的淋巴组织, 移植后免疫反应较其他器官移植更为剧烈, 既有排斥反应, 又有移植物抗宿主反应(GVHR), 再加上小肠肠腔内含有大量的病原菌, 术后易并发肠源性感染, 引起败血症, 使治疗更加困难, 因此, 小肠移植的早期结果并不令人乐观[6].
小肠移植急性排斥反应是以细胞免疫为主、体液免疫共同参与完成的一个复杂的免疫应答过程, T细胞在小肠移植免疫反应中起决定性的作用[7]. RANTES主要是由活化的T淋巴细胞产生的一个-家族的趋化因子, 具有控制单核细胞和淋巴细胞定向迁移的免疫学特性, 在机体的免疫反应调节中起重要作用[8-12]. 我们发现, 在正常大鼠小肠组织中RANTES表达很低, 而异基因移植未治疗组大鼠移植肠RANTES阳性细胞表达在移植后3, 5, 7 d较其他3组明显升高(P<0.01), 结合组织病理学检查发现RANRES表达的动态变化与排斥反应的进程呈正相关. 由此可见, 同种异体小肠移植术后移植肠RANTES表达与急性排斥反应的关系密切. RANTES介导移植排斥反应的机制可能是移植术后, 抗原特异性T淋巴细胞活化增生, 分泌大量的RANTES, 趋化单核细胞和淋巴细胞向移植物定向迁移, T淋巴细胞的活化使IL-2和IFN-等细胞因子产生增加, 又能诱导RANTES的分泌, RANTES含量的不断增加进一步诱导T淋巴细胞活化产生效应, 形成免疫应答不断增强的正反馈过程[13]. 随着RANTES的增加, 免疫炎性细胞浸润增多, 排斥反应进一步加剧.本研究表明, RANTES阳性细胞在小肠移植急性排斥反应中发挥了重要作用, RANTES表达的高低可以间接反映移植物T淋巴细胞浸润的严重程度, 为小肠移植排斥反应的早期诊断提供帮助.目前临床小肠移植排斥反应的诊断只能以临床观察与内窥镜指导下肠黏膜活检的病理学检查相结合的方法为主, 缺乏早期、特异、敏感的指标[14].趋化因子的高表达发生在排斥反应的早期阶段, 因此, 利用激光扫描共聚焦显微镜技术动态检测移植肠RANTES的表达变化可成为小肠移植急性排斥反应有效的诊断指标之一. 同时, 采取以趋化因子为靶位的治疗方案, 可能能达到抗排斥和诱导移植耐受的目的.
FK506是从放线菌Streptomyces tsukubaeasis的代谢产物中提取的大环内酯类物质, 其抑制体外混合淋巴细胞反应、T细胞增生反应以及抑制IL-2和IFN生成作用比CsA强100倍或以上.我们应用FK506治疗的异基因移植组大鼠移植肠RANTES表达显著降低, 病理学检查无明显排斥反应.这说明, FK506能显著抑制T淋巴细胞的活化, 减少RANTES的产生, 延长移植物的存活时间. 此外, 同基因移植对照组和FK506治疗组大鼠术后5, 7 d移植肠RANTES表达轻度升高, 但仍保持在较低水平, 其原因可能还与小肠异位移植后缺乏肠内容物刺激而导致的肠黏膜萎缩和细菌易位有关.
编辑: N/A
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