hMSH2在胃癌组织中的表达及其与DNA甲基化之间的关系

摘要

目的: 分析胃癌组织中DNA甲基化酶Dnmt1和hMSH2表达情况的相关性及与肿瘤生物学行为之间的关系.

方法: 以real-time RT PCR法检测28例胃癌组织中Dnmt1和hMSH2 mRNA的表达, 亚硫酸氢钠变性后测序分析hMSH2启动子区甲基化状态.

结果: 在28例胃癌组织中有9例(32%)DNMT1 mRNA的高表达, 10例hMSH2(35.7%)的低表达, 在hMSH2低表达的胃癌组织中有2例存在DNA启动子区的高甲基化. 两个基因mRNA的表达与胃癌生物学行为包括肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.

结论: 胃癌组织中存在Dnmt1的高表达, DNA甲基化在一定程度上参与了hMSH2基因表达的缺失.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: January 15, 2004
Revised: March 25, 2004
Accepted: April 5, 2004
Published online: July 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

肿瘤组织多有DNA甲基化的紊乱. DNA甲基化由DNA甲基化酶(DNA methylatransferase, Dnmt)催化, 他能将甲基供体提供的甲基集团转移至胞嘧啶5位碳上形成5-甲基胞嘧啶.DNA甲基化酶包括参与甲基化的形成(Dnmt3a 和Dnmt3b的主要作用)和维持(主要是Dnmt1)两类酶. 人类DNA错配修复系统(mismatch repair system, MMR)是由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成, 此系统的存在能避免遗传物质产生突变, 保证DNA复制的高保真度. hMSH2是目前研究较广泛的DNA错配修复基因, 他的失活可导致DNA错配修复能力的降低, 引起微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI), 可使癌基因激活或抑癌基因失活, 诱发细胞癌变[1]. 现已发现, 癌发生过程中导致错配修复基因失活的另一方式为DNA甲基化的改变, 这种改变常伴有错配修复基因表达的丢失[2-3]. 目前对于hMSH2启动子甲基化情况的研究还较少. 我们研究了胃癌组织中DNA甲基化酶Dnmt1和hMSH2表达情况的相关性及与肿瘤生物学行为之间的关系, 并进一步分析了hMSH2启动子区的甲基化状态.

1 材料和方法

1.1 材料

2001-05/2002-07组织学确诊为胃癌的手术患者28例, 临床资料完整, 术前均未进行任何抗肿瘤治疗. 癌组织取自肿块中央非坏死部分, 癌旁组织取自距癌灶边缘5 cm以内的黏膜组织, 正常组织取自距肿块10 cm以上的正常黏膜组织. 所有标本均经本院两位高年资病理科医生证实. 患者平均年龄58.4岁. 行胃癌根治术27例, 姑息性胃大部切除术1例. 病理类型: 溃疡性腺癌6例, 浸润溃疡15例, 弥漫浸润腺癌7例. 临床分期: Ⅰ期2例, Ⅱ-Ⅲ期26例. 淋巴结转移: 21例存在淋巴结转移, 7例不存在.

1.2 方法

RNA的提取和cDNA的合成见文献[4]. 定量PCR检测Dnmt, hMSH2的表达方法见文献[4]. 具体引物和探针见表1. hMSH2 DNA亚硫酸氢钠变性后测序.DNA经亚硫酸氢盐修饰能够使没有甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶, 后者在PCR扩增中以胸腺嘧啶形式扩增, 而原有甲基化的胞嘧啶则保持胞嘧啶不变.处理步骤: 取5 g DNA加NaOH至终浓度为0.2 moL/L, 37 ℃变性10 min. 向变性DNA中加入新鲜配置的10 mmoL/L的氰醌30 ul及3 moL/L的亚硫酸氢钠(pH = 5) 520 ul, 加入矿物油200 ul. 样品于50 ℃孵育16 min. 修饰后的DNA根据说明书用Wizerd DNA纯化树脂(Promega)纯化, 用50 ul水洗脱.加5.5 ul 3 moL/L NaOH至洗脱液, 室温放置5 min. 加17 uL 10 moL/L的醋酸胺, 1 uL的糖原及500 uL的950 mL/L冰冷乙醇, 过夜.14 000 r/min 4 ℃离心30 min, 以700 mL/L乙醇洗沉淀物. 真空干燥, 加20 uL水稀释.处理后的DNA行潮式PCR, 基因bank号AB006445, 引物序列循环1为: 正义5'-TGT TTA GAA AGA AAA AGG GA-3'; 反义5'-AAA CCT CCT CAC CTC CT-3'. 循环2为: 正义5'-AAA TAT TGG GAG GAG GAG GA-3'; 反义5'-ACC CAC TAA ACT ATT TCC CA-3'. 产物片断357 bp, 位于第一外显子上游启动子-32～-388. 两次PCR反应体系均为: 3 L MgCl₂ (25 mmoL/L), 2 L dNTP(2.5 mmoL/L), 10 pmoL上下游引物, 模板2 uL. 产物送上海申友生物科技公司测序.

表1 定量PCR的引物和探针.

Gene	正义引物 (5'→3')	反义引物(5'→3')	探针
β-actin	CTG GCA CCC AGC ACA GAT	GGA CAG CGA GGC CGA ATG	ATC ATT GCT CCT CCT GAG
Dnmt1	GCA CCT CAT TTG CCG AAT ACA	TCT CCT GCA TCA GCC CAA ATA	AGT CCC GAG TAT GCG C
HMSH2	ATC CAA GGA GAA TGA TTG GTA TTT G	CAA AGA GAA TGT CTT CAA ACT GAG AGA	CAT ATA AGG CTT CTC CTG GC

统计学处理t检验, x²检验, 相关分析法.

2 结果

2.1 Dnmt1与hMSH2 mRNA的表达

定量RT-PCR反应良好, 扩增符合要求. 28例胃癌组织中有9例(32%)Dnmt1高表达, 10例(36%)不同程度的低表达; 癌组织平均Dnmt1为5.08±10.11, 明显高于正常组织均值1(P = 0.04). hMSH2 10例(35.7%)低表达, 3例(10.7%)高表达, 其余无明显变化.癌组织平均hMSH2为1.86±3.01, 与正常组织无明显差异(P = 0.14). 在mRNA表达水平上, Dnmt1与hMSH2无显著相关性(P = 0.53).

2.2 hMSH2亚硫酸氢钠测序

将10例hMSH2 mRNA低表达的样品DNA进行测序, 分析其启动子区甲基化情况. 用亚硫酸氢钠测序法可以检测到其中2例存在癌组织DNA启动子区的高甲基化.测序结果见图1. 正常组织中单链DNA CpG中的未甲基化的胞嘧啶已被亚硫酸氢钠脱氨基而变成U, U经PCR扩增后被T代替; 反之, 在癌和癌旁组织相应的甲基化序列中, CpG二核苷酸中的胞嘧啶保持不变, 说明他们因甲基化而未被亚硫酸氢盐修饰, 而CpG二核苷酸以外的胞嘧啶由于未被甲基化, 都变成T(U).

图1 hmsh2测序结果.

2.3 Dnmt1、hmsh2与肿瘤生物学行为的关系

不但如我们前文所述[4]Dnmt1转录水平与胃癌生物学行为不明确关系, 且hMSH2基因mRNA表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.

3 讨论

基因不稳在胃癌的发生中起重要作用.这种基因不稳可以分为二种不同的形式, 即染色体不稳和微卫星不稳.hMLH1和hMSH2是错配修复基因系统中最重要的成员.胃癌hMLH1突变均发生在MSI阳性的癌组织, 但相当一部分MSI阳性胃癌组织并未发现hMLH1和hMSH2基因的突变, 因此可能有其他机制参与了这种缺陷. 目前认为肿瘤发生过程中导致hMLH1失活的另一重要方式为DNA甲基化的改变, 这种改变可引起hMLH1表达的丢失[5]. Dnmt1是体内最重要的DNA甲基化酶, 他能维持DNA的甲基化修饰. 在癌细胞中, Dnmt1基因表达升高往往先于高甲基化改变, 一般认为Dnmt1活性升高是癌组织的一个具有特征的早期分子改变. 很多肿瘤组织存在着不同程度的Dnmt1高表达[6-7]. 但目前对于DNA甲基化是否能引起hMSH2表达缺失仍有异议[8-9].

我们发现32%的胃癌组织存在Dnmt1的高表达, 癌区Dnmt1的表达均值显著高于正常黏膜区(P = 0.04); Dnmt1的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性. 这一结果与日本学者得到的结论相近[10]. 同时, 我们还发现胃癌组织中的Dnmt1高表达以及DNA甲基化在一定程度上参与了hMSH2基因表达的缺失. 我们同时发现这两例存在hMSH2癌组织启动子高甲基化的病例其Dnmt1在mRNA的表达上并无明显变化, 我们猜测Dnmt1可能通过影响hMLH1而非hMSH2的甲基化状态, 从而导致微卫星不稳定, 并进一步参与了肿瘤的进程. 在本次实验中我们没有观察到Dnmt1和hMSH2与肿瘤各种生物学行为之间有相关性. 我们拟进一步研究DNA甲基化与微卫星不稳定之间的关系.

备注

编辑: N/A

参考文献

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