研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-07-15; 12(7): 1717-1720
在线出版日期: 2004-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i7.1717
酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因
邵清, 成军, 白雪帆, 王琳, 张健, 卢成哲, 梁耀东, 刘敏, 李强
邵清, 成军, 王琳, 张健, 梁耀东, 刘敏, 李强, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
白雪帆, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院传染科 陕西省西安市 710039
卢成哲, 中国人民解放军解放军第206医院CT室 吉林省通化市 134001
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-03-15
修回日期: 2004-04-01
接受日期: 2004-05-11
在线出版日期: 2004-07-15

目的: 用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP6蛋白结合蛋白的基因.

方法: 用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV NS3TP6蛋白基因, 连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落, 增菌后提取质粒, 转化入大肠杆菌, 提取质粒并测序, 进行生物信息学分析.

结果: 成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达, 配合后选出在四缺( SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X--半乳糖(X--gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个, 其中 3个人类白细胞CD14抗原, 1个人类免疫球蛋白 λ轻链, 3个人类推定蛋白基因(AC124014, AC097504, AC023785).

结论: 成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白, 为进一步研究HCV的作用提供了新线索.

关键词: N/A

引文著录: 邵清, 成军, 白雪帆, 王琳, 张健, 卢成哲, 梁耀东, 刘敏, 李强. 酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1717-1720
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 15, 2004
Revised: April 1, 2004
Accepted: May 11, 2004
Published online: July 15, 2004

N/A

Key Words: N/A


0 引言

目前, 丙型肝炎病毒(HCV)感染 还缺乏特异有效的治疗措施[1-5], 探索新型防治HCV感染的新方法刻不容缓. 目前关于HCV感染及其致病的分子生物学机制研究还有相当多的未知领域. 探索防治HCV感染的新技术, 必须从HCV致病的分子生物学机制入手.

丙型肝炎病毒(HCV)是单股正链RNA病毒, 其中非结构蛋白NS3基因编码为70 kD的NS3蛋白(631 aa)是一种多功能蛋白质, 具有丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酸酶(NTPase)和RNA解旋酶(helicase)的功能, 在HCV复制及表达产物多蛋白裂解加工上起重要作用[6-10]. 研究表明[11-15], HCV NS3蛋白还可能通过反式激活作用, 调控细胞内多种病毒及细胞基因的转录, 在HCV致病(癌)过程中起着重要的作用. 我们应用微矩阵(microarray)技术对于表达HCV NS3载体转染的HepG2细胞进行研究, 阐明了NS3蛋白反式激活作用的部分靶基因, 同时我们结合生物信息学技术(bioinformatics)克隆了NS3蛋白反式激活作用的新靶基因, 即丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因6(NS3TP6 Genank NM_025190), 为进一步研究HCV NS3TP6蛋白与免疫系统的关系, 我们用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCV NS3TP6蛋白结合蛋白基因[16-24]. 从而为HCV NS3蛋白反式激活作用的新靶基因(HCV NS3TP6)研究提供新的方向.

1 材料和方法
1.1 材料

Saccharomyces cerevisiae AH109酵母株、Y187酵母株(K1612-1)、cDNA淋巴文库, 酵母YPDA培养基、SD/-Trp培养基SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade, X--半乳糖苷酶(Gal)等购自Clontech公司, 半硫酸腺苷、醋酸锂购自Sigma公司. 复杂高效感受态(FSB), 本室自制. 大肠杆菌(DH5), 本室保存.

1.2 方法

HCV NS3TP6的酵母表达载体pGBKT7-HCV NS3TP6用醋酸锂法转入酵母细胞AH109由本室构建. cDNA白文库进行增菌后, 提出质粒, 转化入酵母细胞(Y187), 经文库滴定, 确定文库细胞计数大于1×1012 /L. 挑取在SD/-Trp选择培养基上生长转化子(计数大于1×1012/L)与淋巴文库混合, 30 ℃轻摇配合过夜, 24 h后铺板SD/-Trp/-Leu/ -His 25块、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 25块. 同时进行阳性对照实验及文库滴定. 生长16 d后把长出的大于3 mm的酵母集落, 在铺有 X--半乳糖苷酶的QDO上检查-半乳糖苷酶活性, 认为在QDO培养基上生长且出现蓝色菌落的配合为阳性集落. 挑取真正的阳性集落按照试剂盒提供的操作指南Lyticase法提取酵母质粒. 提取的质粒以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠杆菌, 于含有氨苄青霉素的SOB平板培养, 所获得的菌落经BglII酶切鉴定后测序. 阳性克隆DNA测序后, 提交GenBank进行核苷酸序列同源性比对, 进行生物信息学分析.

2 结果

cDNA测序与同源性分析初步结果配合后筛选出在4缺(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)培养基和铺有X--gal 的4缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落7个克隆测序, 与GenBank数据库进行初步比较, 结果(见表1).

表1 cDNA测序与同源性分析初步结果.
序号筛选出的目的基因同源性相同克隆数
1人类白细胞CD14抗原96-99%3
2人类免疫球蛋白 lambda轻链95%1
3人类推定蛋白198%1
4人类推定蛋白298%1
5人类推定蛋白394%1
3 讨论

丙型肝炎病毒(HCV)基因组编码的非结构蛋白3(NS3)是一种具有多种生物学功能的蛋白质. 除了具有丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶等之外, 对于HCV基因组表达的结构和非结构蛋白的结构与功能具有重要的调节作用[22-30]. 病毒的基因表达调节与真核细胞相似[31-33], 主要是转录水平为主的多水平的调节机制, HCV的表达调节也不例外, 即病毒借助感染的宿主细胞的一些复制和表达的辅助元件完成其生活周期及致病过程. 转录水平的调节根据调节的机制和参与的因素不同, 可以分成顺式(cis)调节和反式(trans)调节两种. 所谓的顺式调节就是分子结构内部的调节, 例如基因启动子序列对基因的转录活性的调节, 增强子序列对启动子转录活性的调节都属于此类. 反式调节的结果, 从调节靶点的效果来看可以分成2类: 上调(up-regulation)和下调(down-regulation). 从参与的反式调节的因素来看, 可以分成病毒对病毒的反式调节、病毒对于肝细胞蛋白编码基因的反式调节、肝细胞蛋白对于病毒基因表达的反式调节等几种不同的情况. 肝炎病毒蛋白作为一类反式激活因子, 常常改变肝细胞中细胞周期(cell cycle)、细胞凋亡(apoptosis)、细胞分化(differentiation)、信号转导(signal transduction)等的相关基因的表达, 在肝炎病毒的致病性和肝细胞癌的发生发展中具有十分重要的作用和意义. HCV感染肝细胞之后, 也存在复杂的反式调节作用, 临床和实验研究显示HCV感染与肝细胞癌(HCC)发生发展过程密切相关, 其中病毒NS3蛋白起到重要的作用. HCV NS3蛋白对细胞信号转导途径, 尤其是血清应答元件(SRE). 激活蛋白1(AP-1)、血清应答因子(SRF)等信号转导途径具有增强作用. Sakamuro et al研究显示[34], NS3 cDNA能够使转染的小鼠成纤维细胞NIH 3T3具有转化特性, 且转化细胞移植入裸鼠体内可形成纤维肉瘤灶, 直接证明了HCV NS3蛋白的恶性转化潜能. NS3还可能通过解旋酶活性诱导肝细胞基因组的不稳定性, 甚至发生突变. 另外, NS3能与蛋白激酶A(PKA)催化亚单位特异结合, 可能干扰RNA与细胞内信号转导过程, 严重干扰细胞正常功能. 刘妍et al研究表明NS3基因重组表达载体在HepG2细胞中表达相应的蛋白[35], 对SV40早期启动子具有反式激活作用, 从而使SV40启动子下游的CAT基因表达增强. 这些都是HCV NS3通过反式激活作用对于靶细胞中细胞周期调节机制干扰的结果, 说明HCV NS3蛋白的反式激活功能在HCV致病中发挥重要的作用, 研究其作用分子生物学机制有助于理解HCV感染的慢性化和致癌作用机制. 我们应用微矩阵(microarray)技术对于表达HCV NS3载体转染的HepG2细胞进行研究, 阐明了NS3蛋白反式激活作用的部分靶基因, 同时我们结合生物信息学技术(bioinformatics)克隆了NS3蛋白反式激活作用的新靶基因, 即丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因6(NS3TP6 Genank NM_025190), 为进一步研究HCV NS3TP6蛋白与免疫系统的关系, 我们用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCV NS3TP6蛋白结合蛋白基因[36-40].

酵母双杂交系统是近年来新发展起来的一种分析真核细胞中蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用的一种有效的基因分析方法, 他的产生为研究蛋白在体内生理情况下的相互作用提供了一种新的遗传学方法. 酵母双杂交系统通过将两个推定有相互作用的蛋白X和Y分别融合到一酵母转录激活因子的BD和AD上, X与Y的相互作用重构了激活因子, 从而导致下游"报告基因"的转录, 产生容易探测到的表型[41-46]. 我们使用的是酵母双杂交系统3[33]. 实验中我们在真核表达载体pGBK-T7中构建pGBKT7-HCV NS3TP6诱饵质粒并在酵母菌株AH109中表达了HCV NS3TP6 基因, 与转化人白细胞cDNA文库的酵母菌株Y187进行配合, 筛选出与之相互作用的蛋白基因5种, 其中包括人类白细胞CD14抗原, 人类免疫球蛋白 λ轻链, 3种人类推定蛋白基因(AC124014, AC097504, AC023785). 人类免疫球蛋白λ轻链的功能是识别抗原, 在细胞信号传导中起重要的作用. 人类白细胞CD14抗原是内毒素或脂多糖受体(LPS), 与肝细胞和免疫细胞的凋亡和HCV感染后免疫障碍有关[47-53]. Caradonna et al研究表明LPS可特异性地与单核/巨噬细胞表面受体CD14结合[47], 在HCV感染的患者内毒素血症致肝细胞损伤的过程中起着重要的作用. Mammaev et al研究表明CD14的表达与肝细胞凋亡正相关[48], 经干扰素治疗, CD14的表达降低. Nakamoto et al用 CD14+单核细胞与CD8+和CD4+T淋巴细胞共孵育的方法[49], 得出CD8+和CD4+T淋巴细胞下降的结果, 其研究表明CD14的表达与CD8+和CD4+T淋巴细胞的凋亡有关.

通过以上结果提供的这些线索, 我们可以进行更深入的研究, 进一步弄清各种蛋白与HCV NS3TP6的相互作用及HCV NS3TP6 确切的作用, 为寻找阻断HCV感染及HCC发生的有效方法探索新道路. 当然, 这些结合蛋白的发现只是研究病毒蛋白功能的一个起点, 在极其复杂的体内环境中, 需要更多的实验证据来揭示这种结合的生物学意义.

编辑: N/A

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