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世界华人消化杂志. 2004-07-15; 12(7): 1714-1717
在线出版日期: 2004-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i7.1714
大鼠肝再生相关基因LRRP1的人同源基因是一种新型琥珀酸脱氢酶的亚单位编码基因
成军, 王刚, 刘妍, 邵得志, 张玲霞, 陈菊梅
成军, 王刚, 刘妍, 邵得志, 张玲霞, 陈菊梅, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金资助课题, No. C39970674, No. C03011402; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-03-15
修回日期: 2004-04-01
接受日期: 2004-05-11
在线出版日期: 2004-07-15

目的: 应用分子生物学和生物信息学方法, 寻找、克隆大鼠肝再生相关基因LRRP1的人的同源基因, 阐明LRRP1基因的结构和功能, 为研究肝脏再生调节的分子生物学机制奠定基础.

方法: 利用美国国立卫生研究院建立的核苷酸数据库(GenBank)以及相应的核苷酸序列同源性搜索分析软件(BLASTN), 以大鼠的LRRP1的cDNA序列作为参照, 对于人的同源性cDNA序列进行搜索分析, 寻找人的LRRP1的同源基因序列. 利用蛋白质一级结构序列的数据库以及相应的同源蛋白序列的搜索分析, 阐明人LRRP1蛋白质一级结构与已知蛋白序列的同源性, 从而根据蛋白质一级结构的相似性, 对于新克隆基因进行功能方面的预测分析. 应用在线软件的分析, 对于人LRRP1蛋白质一级结构序列进行分析预测, 分析其氨基末端序列是否具有信号肽序列, 以判断人LRRP1蛋白是否是一种可以分泌表达的蛋白; 同样对人LRRP1蛋白质一级结构序列进行在线软件的分析, 对于人LRRP1蛋白质分子结构中的潜在的糖基化位点以及其他类型的修饰位点进行预测.

结果: 人的LRRP1的编码基因由480 nt组成, 编码产物由159 aa组成. 人LRRP1的蛋白质一级结构序列与人琥珀酸脱氢酶亚单位D、牛琥珀酸脱氢酶亚单位D高度同源, 同源性分别为79% (126/159), 78% (123/156). 人LRRP1是一种分泌蛋白, 在其分子结构中具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和豆蔻脂化修饰位点.

结论: 人LRRP1蛋白是一种新型的琥珀酸脱氢酶的亚单位编码基因.

关键词: N/A
引文著录: 成军, 王刚, 刘妍, 邵得志, 张玲霞, 陈菊梅. 大鼠肝再生相关基因LRRP1的人同源基因是一种新型琥珀酸脱氢酶的亚单位编码基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1714-1717
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 15, 2004
Revised: April 1, 2004
Accepted: May 11, 2004
Published online: July 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

肝脏是一种具有极强的再生能力的器官之一. 正常肝脏一般都处于静止状态, 但是如果出现肝脏损伤的情况, 如肝脏部分切除(手术)、化学性肝损伤(药物中毒)、病毒感染后的肝损伤(各种急、慢性病毒性肝炎)、肝脏肿瘤(肝细胞癌)等原因造成肝脏细胞损伤和坏死, 都可以立即诱发和启动肝脏的再生过程[1-3]. 肝脏损伤和再生的过程涉及到非常复杂的分子生物学机制, 研究肝脏再生的分子生物学机制, 探索参与肝脏再生过程的因素及其调节作用, 对于肝脏疾病的防治、探索新型的治疗方法和药物具有十分重要的意义. 为了研究在肝再生过程中参与的新的基因, 我们首先建立了肝脏部分切除的大鼠模型, 对于静止期肝脏和再生过程中的肝脏的基因表达谱, 利用抑制性消减杂交(SSH)技术进行筛选[4-6], 获得了一系列与肝脏再生相关的基因类型, 其中包括大鼠肝脏再生相关蛋白1(LRRP1)[7]. 为了研究不同种属生物LRRP1的同源基因, 探索其生物学功能, 我们利用生物信息学(bioinformatics)技术[8-10]对于大鼠LRRP1的人的同源基因进行了研究和分析, 发现人LRRP1是一种琥珀酸脱氢酶的新的亚单位.

1 材料和方法
1.1 材料

大鼠LRRP1的基因克隆化的基本过程见文献. 人LRRP1的基因克隆化利用不同种属生物基因同源的原理, 利用美国国立卫生研究院(NIH)的生物工程学研究所(NCBI)建立的核苷酸数据库GenBank进行同源基因序列的比对和搜索, 发现cDNA序列AY358788与我们克隆的大鼠的LRRP1的cDNA序列有高度的同源性. AY358788基因序列是基因组研究计划中的一部分, 并不是功能性的克隆化策略, 也不清楚AY358788这一基因存在的真实性和生物学功能. 从核苷酸序列同源性的比对结果来看, AY358788基因与我们的LRRP1基因序列有着高度的同源性, 认为AY358788就是大鼠LRRP1的人的同源基因序列.

1.2 方法

以人的LRRP1蛋白质一级结构序列作为参照, 应用蛋白质一级结构序列的数据库进行分析(http: //www.ncbi.nlm.gov.nih/blast/swissprot), 在蛋白质一级结构序列的常用数据库Swissprot数据库中发现了人的LRRP1与人的琥珀酸脱氢酶亚单位D和牛的琥珀酸脱氢酶亚单位D高度同源. 因为人LRRP1的蛋白质一级结构与人琥珀酸脱氢酶D亚单位的序列高度同源, 但又不完全一致, 因而对于人LRRP1的结构和功能的预测具有非常重要的价值. 目前根据已知蛋白信号肽序列的性质和比较结果, 建立了蛋白信号肽序列的预测方法和计算机软件系统, 我们应用在线软件系统http://www.stepc.gr/cgi-synaptic/sigfind, 对于人LRRP1蛋白质信号肽序列进行预测分析.对于人LRRP1蛋白质潜在修饰位点序列的计算机预测, 应用的软件系统是http://us.expasy.org/prosite.

2 结果
2.1 人LRRP1的基因克隆化

利用生物信息学技术, 发现在核苷酸序列数据库GenBank中存在与大鼠LRRP1的同源的来源于人的基因序列. 其中一段cDNA序列与大鼠LRRP1的基因序列高度同源, 从而确定为人的LRRP1, 即大鼠LRRP1的人的同源基因. 对于人LRRP1的基因序列及其编码产物的一级结构进行分析, 结果表明人LRRP1的编码基因序列为480 nt, 编码产物由159 aa组成, (图1).

图1
图1 大鼠肝再生相关基因LRRP1的人同源基因及其编码产物一级结构序列.
2.2 人LRRP1蛋白同源序列的分析

以人的LRRP1蛋白质一级结构序列作为参照, 对于蛋白质一级结构序列的数据库(http:www.ncbi.nlm.gov.nih/blast/swissprot)进行搜寻, 发现人LRRP1的蛋白质一级结构序列与人琥珀酸脱氢酶亚单位D、牛琥珀酸脱氢酶亚单位D高度同源, 同源性分别为79% (126/159), 78% (123/156), 表明人LRRP1属于琥珀酸脱氢酶亚单位D的一个新的同源蛋白(图2), 其基本功能就是构成琥珀酸脱氢酶.

2.3 人LRRP1蛋白的信号肽序列分析

利用生物信息学技术的在线分析(http://www.stepc.gr/cgi-synaptic/sigfind), 对于人LRRP1的潜在的信号肽序列进行分析, 发现人LRRP1蛋白质序列中的氨基末端45个氨基酸残基(MAVLLKLGVLCSGQGARALLLRSRV VRPAYV SAFLQDQPTQGRCG)组成了人LRRP1的信号肽序列, 表明人LRRP1是一种可以分泌的蛋白类型.

2.4 人LRRP1蛋白质结构中潜在修饰位点的分析

利用在线软件(http://us.expasy.org/prosite/)对于人LRRP1蛋白质一级结构中存在的潜在的修饰位点进行分析, 结果表明: 在人LRRP1蛋白分子结构中, 第68-70位的氨基酸残基序列(SER)存在潜在的蛋白激酶C(PKC)的磷酸化位点; 在89-92 aa(SVVD)存在酪蛋白激酶II磷酸化位点; 在8-13 aa(GVLCSG)、58-63 aa(GSKAAS)、78-83 aa(GLIPAG)、108 -113 aa(GQVVTD)和148-153 aa(GICRAV)分别存在潜在的N-豆蔻脂化位点.

3 讨论

许多与细胞周期、细胞凋亡和细胞信号转导相关的基因几乎都参与了肝脏再生的分子生物学调节机制和过程[11-15]. 我们采用肝脏70%手术切除后12 h时间点, 此时的基因表达对于早期阶段肝脏再生过程的调控具有十分重要的意义. 由于本项研究旨在发现肝脏再生过程中相关的新的基因序列, 因此我们采用的技术途径和方法主要是抑制性消减杂交(SSH, suppression subtractive hybridization)技术. 这种SSH技术, 对于2个具有可比性的系统的基因表达谱进行比较研究, 但是对于研究的对象基因又没有先决条件, 所以是一种十分有效的研究技术途径, 这一点优于基因表达谱新技术, 因在基因表达谱芯片技术研究中, 芯片制备时点样的基因类型就决定了表达谱芯片的检测范围, 因而不利于发现更多的新的基因类型. 我们对于大鼠70%肝脏部分切除模型的基因表达谱进行分析, 发现了一种新的基因, 命名为LRRP1, 本文应用生物信息学技术, 确定了人LRRP1的核苷酸和蛋白质一级结构序列. 利用在线软件分析结果表明, 人LRRP1是一种分泌性的蛋白类型, 在其蛋白质一级结构的氨基末端有一段由45年a组成的信号肽序列. 对于已知蛋白序列数据库的搜索结果表明, 人LRRP1是一种新型的琥珀酸脱氢酶复合体亚单位分子. 在人LRRP1分子结构中, 还存在着潜在的N-糖基化位点、PKC磷酸化位点和豆蔻脂化位点等.

在肝脏再生的调节机制中, 一系列的生长因子参与这一复杂的调节过程, 如肝细胞生长因子(HGF)、肝再生增强因子(ALR)、表皮生长因子(EGF)等. 特别是ALR在肝脏再生中的作用近年来受到了广泛的重视.寻找与肝脏再生相关的新型蛋白药物, 利用基因重组技术表达纯化促进肝脏再生的新型药物, 具有十分重要的意义. 我们利用基因工程技术, 经过发酵和蛋白质纯化等过程, 制备了重组的人ALR蛋白, 在体内实验中发现这种生长因子蛋白可以显著减轻四氯化碳引起的小鼠的急性肝损伤, 为进一步推进重组ALR的产业化, 奠定了坚实的基础[16-19].

编辑: N/A

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