0 引言
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个困扰全球的健康问题, 世界范围内大约有3.5亿人感染HBV, 其中亚洲占了3/4, 仅中国就有近1.3亿人携带HBV[1]. HBsAg携带率达9.75%, 慢性乙型肝炎患者达3 000万人, 其中约10-20%发展成为肝硬变, 1-5%可演变成为肝细胞癌(HCC). 近来国内外对慢性乙型肝炎治疗已有了很大进展, 主要采用抗病毒、免疫调节、改善肝功能和防止慢性化发展等综合治疗. 近些年来, 肝病学界已达成共识, 认为抗病毒治疗是其中最主要、最根本的治疗措施, 目前用于病毒性肝炎抗病毒治疗的药物主要有二类, 一类是抗病毒药物, 具有直接抑制及杀灭病毒的作用; 另一类是免疫调节剂, 通过调节人体的免疫功能, 从而抑制及清除肝炎病毒. 但是这些药物的效果还不稳定, 治疗费用昂贵, 所以不论是从疗效的角度, 还是从经济角度, 人们都在寻求一种有效的方法来预测药物的效果及进一步指导用药. 先前人们选用免疫学的方法来预测抗病毒药物的疗效, 随着现代分子生物学的快速发展, 又为慢性乙型肝炎抗病毒治疗相关研究提供了新的机遇与挑战, 人们通过监测治疗前、治疗时及治疗后病毒载量的变化可更准确的, 更量化的预测药物的疗效, 并为治疗措施的制定提供有力的依据.
1 乙型肝炎病毒在细胞内的复制与清除
在HBV复制循环过程中, 一个重要的特征是共价闭环(ccc)或超螺旋DNA分子的形成, 作为一种病毒的微染色体而存在[2]. 虽然HBV仅在宿主细胞内复制, 病毒本身不能引起肝细胞病变, 但是HBV通过细胞内免疫引发的肝损害是慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因[1].
乙型肝炎患者自体每日可清除外周血中大量HBV. 根据最近对HBV在人体内动力学研究, HBV的半衰期为26.4 h, 病毒存活期为36.6 h, 日更新率为48%, 所以控制人体病毒感染的关键在于清除HBV cccDNA, 抑制病毒复制[3-4]. Guidotti et al[5] 的研究得出在动物模型中, 病毒第一阶段的清除主要通过非细胞病理的作用清除或抑制cccDNA的产生, 可能是通过细胞因子的作用. Whalley et al[6]在对人急性HBV感染的动力学研究中, 得出病毒清除第一阶段半衰期的平均数与动物模型中cccDNA半衰期相一致[7]. 该项研究提示病毒初始阶段的清除机制或许与cccDNA的清除相关; 但是该实验不能得出在病毒生活周期的下游阶段可能受到的抑制作用, 这些还需要大量直接的实验加以验证. 于是人们期望着能通过清除HBV的复制模板cccDNA来降低被感染细胞的产病毒的能力, 由此可导致血清中相关病毒DNA的降低.
2 抗乙型肝炎病毒的治疗
慢性HBV感染常常是由于早期暴露于HBV的结果, 导致了病毒在缺乏强大抗体与细胞内免疫反应的情况下长期存在[8]. 如果人体的免疫机制不能及时清除HBV在体内的持续存在与活跃复制, 必将导致肝组织损伤的不断进展. 因此, 要想阻止肝脏进行性损害, 必须采取有效药物清除或抑制HBV的复制, 也就是说抗病毒治疗是控制慢性乙型肝炎的最主要、最根本的治疗措施.
目前用于抗病毒治疗的药物主要有两类, 一类为细胞因子, 如干扰素, 有三种, 干扰素疗效相似, 临床应用较广泛, -干扰素疗效较差, 应用受到限制. 他们一方面通过免疫调节发挥作用, 另一方面也可直接抗病毒, 然而IFN的治疗效果是有限的, 长期应用才可抑制HBV复制, 获得持久性效应. IFN治疗慢性乙型肝炎的治疗效果和疗程有关, 治疗近期疗效较高, 远期疗效尚低, 如果有针对的选择病例, 可以提高疗效. 因为其不能清除cccDNA, 停药后可再次复制, 也不能清除已整合入的细胞基因组的病毒基因, 而且长期使用有很多的副作用, 于是出现了另一类可大量直接抗病毒的药物, 即核苷类似物, 通过抑制病毒聚合酶来阻止病毒的复制, 如拉米夫定、泛昔洛韦、阿昔洛韦已用于临床, 阿德福韦、恩他卡韦和BMS-200475也正在进行临床试验. 其中拉米夫定是最具代表性的一个, 在HBV复制循环过程中, 病毒的逆转录酶是合成新的HBV DNA的前基因组mRNA模板所必需的, 由此拉米夫定可阻止已被病毒感染的细胞生产新病毒[9]. 另外病毒的聚合酶是病毒进入细胞核之前形成双链环状DNA所必须的[10], 故拉米夫定还可阻止病毒感染新的细胞[11]. 他与IFN的不同之处是其不影响机体的免疫系统, 最早用于治疗免疫缺陷型病毒, 后来发现其对HBV也有明显的抑制作用, 而且作用迅速, 可降低HBV DNA低度可达106, 7拷贝/L, 已广泛用于临床. 但是其对HBV的抑制作用是可逆的, 停用药物后HBV DNA又反复出现, 低于或相当于基础水平, 而且也不能完全清除cccDNA, 更不能清除已与细胞基因组整合的病毒, 使HBsAg消失. 只有长期使用, 持续性抑制HBV复制直至消耗cccDNA, 才可获得持久性效应[12], 但是YMDD变异的存在, 对其在临床中的应用提出了挑战, 患者的选择及停药时机的选择都是至关重要的. 近年来有效的抗病毒药物的使用大大促进了人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)感染的动力学数学分析的发展[13]. 反过来, 在抗病毒的治疗过程中, 对于这些病毒感染的动力学的深入理解不仅为病毒发生机制提供了动力学图谱, 而且也为设计合理的治疗措施提供了有力的依据, 使人们越来越意识到研究病毒动力学的重要性及其临床意义.
3 乙型肝炎病毒载量
3.1 与抗原抗体的模式关系
早期人们多采用血清学方法进行乙型肝炎病原学诊断, 预测其传染性、疾病进程及预后. 在病毒复制过程中, 也表达病毒特异蛋白, 这些蛋白可激发机体的免疫系统, 产成相应的抗体, 故可通过检测抗原抗体来间接反应病毒的复制水平. Gerken et al[14]用IFN治疗慢性活动性肝炎期间, 发现抗-HBcIgM和病毒载量有很好的相关性; 隋云华et al[15]通过对838例各型乙型肝炎患者血清HBV DNA定量, 得出HBV DNA定量与HBsAg、HBeAg、HBcAb 阳性的符合率为94.4% , 显示了极好的特异性. 但是免疫学检测存在许多无法克服的问题, 如抗原变异、免疫交叉反应、免疫复合物的形成[16], 这些都影响着血清学检测方法的灵敏度和准确性的进一步提高, 另外HBV的表达和机体的免疫反应的强弱受多种因素的影响, 免疫学指标与临床现象及病毒载量有可能不完全吻合. 随着逆转录酶抑制剂的广泛使用, 病毒变异的广泛存在, 紧紧依靠免疫学指标已经不能完全解释许多临床现象. 血清学检测不能准确地反应病毒的复制, 故病毒载量的检测被越来越广泛地用于临床诊断. 有学者在分析免疫学检测与病毒载量检测之间的关系时得出, HBsAg, HBcAb 阳性, HBsAg, HBeAb, HBcAb阳性组, HBV DNA的阳性率分别为38.6%和27.3%, 显示了HBV DNA定量的灵敏性. 随着一些抗病毒药物的有效应用, 临床中发现某些HBeAg阳性的乙型肝炎患者的HBV DNA呈阴性结果, 提示血清学标志反映HBV复制状态存在局限性. 李文清et al调查了20例乙型肝炎患者(16例HBeAg阳性和4例HBeAb阳性)在拉米夫定治疗期间, 经12 wk和24 wk治疗后, 其HBV DNA含量迅速下降, 部分HBV DNA含量低于检测范围, 而呈阴性结果, 其阳性率分别仅为75.0%和55.0%, 而血清学标志无1例发生变化. 表明在抗病毒治疗期间, 血清学标志的变化滞后于HBV DNA含量的变化, HBV DNA定量检测是反映HBV复制和药物疗效的判断最直接、可靠的指标[17].
既往一般认为, 血清HBeAg阴转或抗-HBe出现预示病毒复制水平降低或病变趋于恢复[18], 但有报道指出HBeAg阳性患者的病毒载量比HBeAg阴性患者的高[19], 在其调查的116例患者中有42例(36.1%)血清HBeAg阴性, 但仍可检出HBV DNA, 部分病例HBV DNA水平还较高, 提示HBeAg阴转不能认为HBV复制减少或停止. 近年的研究发现, 这些患者中多数伴有HBV前-C区的基因突变, 特别是第1896位核苷酸的突变, 致使前-C区第28位密码子(TGG)转变为翻译终止密码子(TAG), 导致HBeAg的合成、分泌障碍, 但却不影响HBV的复制[20]. 这种变异的HBV比野生型HBV更不易被机体清除, 因而更易引起乙型肝炎慢性化、慢性肝炎恶化, 且与重型肝炎和肝癌密切相关[21]. 因此, 血清HBeAg阴性而HBV DAN含量高的患者应引起临床上重视, 慢性乙型肝炎(CHB)患者随着肝损害程度的加重, 血清HBV DNA含量却逐渐下降, 提示病情可能越重, 病毒复制水平越低. 这可能与CHB患者机体的体液和细胞免疫应答在造成肝损害的同时, 也中和和清除血循环中的病毒颗粒有关[22], 表现为免疫损伤越严重, 肝损害程度也越严重, 血清HBV DNA含量越低. 此外, 随着病程的延长, 病情的加重, 部分HBV DNA被整合到宿主肝细胞中, 致使血清HBV DNA含量降低. 因此, CHB患者定量检测血清HBV DNA含量对临床判断肝损害程度, 指导抗病毒治疗, 估计其预后有重要意义.
3.2 病毒动力学
病毒的动力学研究主要通过假设的数学模型, 结合抗病毒药物作用下病毒载量的动态变化数据求解得到的病毒感染动力学特征的基本参数. 了解病毒感染动力学过程, 可以更清楚的理解病毒感染发生、发展、转归以及药物治疗效果. 最初的病毒动力学原理的研究是源于对HIV感染动力学分析, 并促进了病毒动力学的发展. 在慢性病毒感染的患者中, 病毒的水平通常被认为达到一个稳定或恒定水平, 然后保持这一状态很多年. 为了保持这一恒定的水平, 机体必须以同样的速率清除和生产病毒. 如果不保持清除与产出平衡的话, 那么病毒的数量就会慢慢地增加. 一旦恒定点建立, 测量病毒载量将不能证实病毒的生产是减慢了, 还是加速了. 因此为了获得病毒生产与清除率的信息, 不得不用抗病毒药物打乱该系统. 例如, 如果病毒生产能够完全被阻止, 那么病毒载量将会下降, 他下降的速率是清除的速率. 如果病毒的生产不能完全被阻止, 那么病毒载量下降的速率将不仅仅依赖于病毒清除的速率, 而且也依赖于生产病毒的细胞的死亡率和抗病毒药物的效果[23].
目前HBV动力学研究也有报道, 获得了一些重要参数[24], 该参数包括病毒感染, 细胞的死亡及抗病毒药物的疗效. 其中基本的动力学模型可用于研究HBV的感染, 计算慢性感染过程中平衡病毒学载量, 也适于研究抗逆转录病毒的抗病毒治疗. Whalley et al[6]通过检测急性HBV感染者病毒潜伏后期和临床期血清病毒载量的动态变化, 研究了HBV感染动力学过程. HBV复制很快, 在2.2-5.8(3.7±1.5 d), 经过一个峰值后, 血清中病毒载量达到约1013拷贝/L. HBV DNA的清除经过2-3阶段下降, 第一阶段为快速下降期, 半衰期为3.7±1.2 d, 接近于在其他嗜肝病毒中所观察到的cccDNA通过非细胞病理机制清除时的半衰期. 最后的病毒清除阶段半衰期范围很广泛, 在4.8-284 d之间, 这可能与感染肝细胞的清除率有关. 游离病毒的半衰期大多数为1.2±0.6 d. 他们估计在病毒复制高峰每天至少产生1013个病毒, 平均一个感染肝细胞每天最多能产生200-1 000个病毒. Nowak et al[25]通过假设拉米夫定完全阻断了病毒对细胞的感染, 使感染细胞数量维持恒定, 从而建立了一个数学模型, 提出了病毒清除表现为双期过程的理论. Tsiang et al[26]对Nowak数学模型作了修正, 他们假设感染的细胞并不维持恒定, 引入了病毒抑制效率参数. 应用修正后的模型评价了阿德福韦对病毒的抑制效率参数, 得出30 mg/d阿德福韦对病毒的抑制效率为0.993±0.008, 即治疗期间每天仍有0.7%的病毒产生. Lowin et al[27]提出病毒的下降模式可能存在更复杂的多阶段模式-阶梯式. 通过对病毒动力学的研究了解病毒在清除过程中的特点, 从而可指导临床评估药物疗效, 以及针对不同的患者设计合理的治疗方案.
3.3 动态学检测与抗病毒治疗
病毒载量一般指每毫升血清中病毒拷贝数, 也表示肝脏病毒含量. 血清中, 病毒DNA水平与病毒含量一致, 病毒载量和病毒DNA水平意义相同; 但肝脏中的病毒DNA水平包括已包装和待包装的病毒DNA, 因此病毒载量和病毒DNA水平不完全等同. 感染细胞和血清中的病毒半衰期均很短, 因此血清病毒水平反应了病毒的复制水平, 但病毒载量并不完全反映病毒的复制水平, 其反映的是检测前感染细胞释放的病毒与被清除体外的病毒的累积差值. 数值大小不直接与感染细胞生成速度(复制水平)有关, 而是与感染细胞的破坏速度和机体清除游离病毒的速度有关. 病毒载量可以通过测定病毒基因组来确定[28]. 病毒载量在不同患者、不同发病阶段和不同发病类型中, 相同大小的病毒载量可能表示不同的临床意义. 以前, 病毒载量的检测仅用于基础研究, 现在被广泛用于常规的病毒学诊断, 并且检测试剂已大量商品化. 在临床病毒学中, 病毒载量的测试主要用于四个目的: 即病毒学诊断; 评估患者的预后; 作为检测抗病毒治疗效果的标志; 评估患者的传染性, 即传播的危险性.
病毒载量定量检测使人们能够比较清楚地了解病毒在体内的致病作用, 弥补了免疫学方面的不足. Nowak et al[3]对使用拉米夫定治疗的患者进行了随访观察, 监测其病毒载量的变化, 利用数学模型分析病毒载量下降的特点、治疗的效果. 结果发现, 在治疗的第2-4 wk, 血清中病毒DNA降低分两阶段进行. 第一阶段主要是游离病毒的清除, 第二阶段主要是生产病毒的被感染细胞的清除. 当患者停止使用拉米夫定, 病毒水平将会迅速增加至初始的稳定阶段. Zeuzem et al[29]和Tsiang et al[26]也观测到了病毒载量分两阶段下降这一特征. 从这些研究中, 按每天50%的反复率可估计游离HBV的半衰期约为24 h, 游离病毒的生产率约每天1012, 被感染细胞的半衰期为10-100 d. Lowin et al[27]指出病毒的下降模式在一些患者中可能更加复杂, 患者采用拉米夫定联合泛昔洛韦, 或联合其他的核酸类似物, 采用实时PCR法监测病毒的下降模式. 结果发现对部分患者而言, 病毒水平不是按照前面所描述的典型的两阶段模型下降, 其下降模式更像阶梯式, 提示HBV病毒动力学或许比先前提及的更为复杂, 另外有两例患者血清中的HBV DNA更加快速的被清除, 提示先前估计的游离病毒的半衰期为24 h并不是普遍存在的. Tsiang et al[26] 在近来的阿德福韦Ⅱ期临床研究过程中, 有15例慢性HBV患者接受了每天使用30 mg阿德福韦, 持续了12 wk, 结果血浆中HBV水平下降了104.1. 虽然病毒清除的第一阶段及第二阶段的初始阶段与先前的两阶段模式相符合, 但是病毒载量实际上处于不稳定状态, 在第二阶段中病毒DNA以更低的速率持续下降, 病毒载量的变化甚微, 在治疗30 d Nowak et al[25] 的模型不再适用. 血浆中病毒水平迅速和持续的降低依赖于病毒生产有效的抑制, 因为这些都是由抗病毒治疗的剂量与效力所决定的. 病毒生产完全抑制的缺乏, 病毒彻底清除与肝纤维化危险性的降低及肝细胞癌的发展将主要依靠被感染细胞降低的有效率[30-31]. 显然还需要大量的研究来证实这些有意义的发现.
血清HBV DNA检测对监测病毒载量的变化起到重要的作用, 但是肝组织中的HBV DNA的检测可更准确地反映病毒的复制情况. 张光曙 et al[32]通过肝活检, 检测肝组织HBV DNA, 结果发现在急慢性HBV感染中可提高确诊率, 尤其是慢性感染. 研究观察证实血清内的HBV DNA检出率和HBV DNA含量均明显低于肝细胞, 提示肝细胞内HBV DNA阴转可能晚于血液, 因而提示在抗病毒治疗时, 血内HBV DNA阴转并不能说明肝细胞内亦已阴转, 在血液内HBV DNA阴转不应随即停止治疗, 应结合临床表现及肝组织中HBV DNA是否阴转来判定. 故除了监测血清中病毒载量的变化外, 应该进一步检测肝组织中的病毒DNA, 因为其能更准确地反映病毒的复制状况, 但是由于取材较复杂, 故临床的应用受到限制.
病毒载量及其动态变化与临床现象的关系比较复杂, 需准确观察低复制病毒的微量变化; 逆转录酶抑制剂的应用提高了乙型肝炎的治疗效果, 但这类药物可引起HBV耐药毒株的出现, 从而引发停药后反弹, 是目前在乙型肝炎治疗中比较棘手的一个问题[33-35]. 故应针对不同患者具体的发病阶段和治疗措施, 适时、动态的测定多个时间段的病毒载量, 在治疗期间预测耐药毒株, 及时调整治疗方案, 这些都对HBV的治疗有重要意义.
