基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-07-15; 12(7): 1604-1607
在线出版日期: 2004-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i7.1604
螺内酯对大鼠肝纤维化及TGFβ1 TIMP-1表达的作用
黄欣, 朱纲, 王磊
黄欣, 朱纲, 王磊, 上海市第九人民医院消化内科 上海市 200011
黄欣, 女, 1973-07-19生, 福建省莆田市人, 汉族, 主治医师.
通讯作者: 黄欣, 200011, 上海市第九人民医院消化内科. huangx201@sina.com.cn
收稿日期: 2004-03-26
修回日期: 2004-04-01
接受日期: 2004-04-15
在线出版日期: 2004-07-15

目的: 探讨醛固酮受体拮抗剂螺内酯对TGFβ1和TIMP-1表达的作用, 评价螺内酯的抗纤维化作用.

方法: ♂SD大鼠34只, 随机分为3组. 肝硬化模型组: 400 mL/L CCl4油3 mL/kg, sc, 2次/wk; 螺内酯组: CCl4油注射的同时予螺内酯20 mg/(kg/d)灌胃; 正常对照组: 正常饮食、饮水. 光镜下动态观察组织学改变, RT-PCR检测肝组织中TGFβ1和TIMP-1的表达.

结果: 10 wk时, 螺内酯组肝纤维化级别显著低于肝纤维化模型组(P<0.05); 但在13 wk, 螺内酯组与肝纤维化模型组相比无显著性差异. 肝纤维化时TGFβ1和TIMP-1 mRNA水平与正常组相比显著升高(P<0.05). 在10 wk时, 螺内酯组TGFβ1 TIMP-1 mRNA水平与肝纤维化模型组相比有下降的趋势, 但无显著性差异.

结论: TGFβ1和TIMP-1在肝纤维化时表达显著增加, 螺内酯对肝纤维化有一定程度的抑制作用, 但对TGFβ1和TIMP-1 mRNA的表达作用不明显.

关键词: N/A
引文著录: 黄欣, 朱纲, 王磊. 螺内酯对大鼠肝纤维化及TGFβ1 TIMP-1表达的作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(7): 1604-1607
Effects of spironolactone on rat liver fibrosis and expression of transforming growth factor β1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1
Xin Huang, Gang Zhu, Lei Wang
Xin Huang, Gang Zhu, Lei Wang, Department of Gastroenterology, Ninth People's Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011, China
Correspondence to: Xin Huang, Department of Gastroenterology, Ninth People's Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011, China. huangx201@sina.com.cn
Received: March 26, 2004
Revised: April 1, 2004
Accepted: April 15, 2004
Published online: July 15, 2004

AIM: To identify the effects of spironolactone on expressions of transforming growth factor β1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and to evaluate the curative effect of spironolactone.

METHODS: Thirty four male SD rats were randomly divided into 3 groups: Hepatic fibrosis model group: the rats were injected with 400 mL/L CCl4 3 mL/kg subcutaneously two times a week; Spironolactone group: the rats were injected with 400 mL/L CCl4 3 mL/kg subcutaneously two times a week; Spironolactone equivalent to 20 mg/kg per day was given intragastrically; Normal control group: normal chow. Hepatic tissue was observed with light microscopy to compare histological alterations dynamically. The expression of transforming growth factor β1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 was detected by RT-PCR.

RESULTS: The grades of fibrosis in spironolactone group were less than those in hepatic fibrosis model group at the end of the week 10 (P < 0.05). However, at the end of week 13, there was no significant difference between the two groups. The expression of TGFβ1 and TIMP-1 mRNA was up-regulated when fibrogenesis occurred (P < 0.05). Although at the end of week 10 there was an inclination that the levels of TGFβ1 and TIMP-1 mRNA in spironolactone group were less than those in hepatic fibrosis model group, there was no significant difference between two groups.

CONCLUSION: The expression of TGFβ1 and TIMP-1 mRNA is up-regulated significantly when fibrogenesis occurs. Spironolactone may have a fibrogenesis-inhibiting effect on CCl4 -induced hepatic fibrosis in some degree. Spironolactone has no significant effect on the expression of TGFβ1 and TIMP-1 mRNA

Key Words: N/A
0 引言

肝损伤时释放转化生长因子1(TGFβ1)等可直接激活肝星形细胞(HSC), 而活化的HSC又可自分泌TGFβ1进一步发挥作用. 在肝纤维化形成过程中, 除了胶原的合成增多外, 胶原降解减少也是一个重要因素. I, Ⅲ型胶原主要由基质金属蛋白酶-1(MMP-1)降解, 金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)可与MMP-1特异性结合而抑制其活性. 肝纤维化时TIMP-1的表达显著增加[1-14]. TGFβ1不仅能促进胶原的合成, 而且可增加TIMP-1表达[15], 因而是肝纤维化过程中关键的细胞因子之一. 近年来的研究表明, 除肾上腺外, 心脏、血管、脑、肝、肺、肾等均能合成醛固酮, 并且在器官纤维化中具有重要作用.醛固酮受体拮抗剂螺内酯能有效减轻心脏和肺的纤维化程度[16-24]. 为了探讨螺内酯对肝纤维化的作用及其机制, 我们研究了螺内酯对CCl4诱导的大鼠肝纤维化程度以及肝组织TGFβ1和TIMP-1表达的作用.

1 材料和方法
1.1 材料

♂SD大鼠34只, 清洁级, 质量250-300 g. 购自上海中英合资必凯公司. 随机分为3组. 肝纤维化模型组(15只): 400 mL/L CCl4(精制橄榄油配制)sc, 3 mL/kg, 2次/wk; 螺内酯组(13只): 在CCl4诱导肝纤维化的同时, 予螺内酯(溶于蒸馏水中)20 mg/(kg/d)灌胃; 正常对照组(6只): 正常饮食、饮水. 分别于造模后10, 13 wk末处死肝纤维化模型组及螺内酯组大鼠各6只, 正常对照组6只大鼠全部于13 wk末处死. 取肝脏右叶组织, 中性甲醛固定, 石蜡包埋, 切片, HE染色后由同一病理专科医师按文献[25]标准进行肝纤维化分级. 0级正常, 6级为早期肝硬化. RT-PCR试剂盒、dNTP、TaqDNA聚合酶等均为大连Takara公司产品. 所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. TGFβ1引物序列为上游5'CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC3', 下游5'CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC 3', 扩增长度324 bp; TIMP-1引物序列为上游: 5'GACCTGGTCATAAGGGCTAAA 3', 下游: 5'GCCCGTGATGAGAAACTCTTCACT 3', 扩增长度219 bp; -actin引物序列为上游: 5'GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA 3', 下游: 5'CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC 3', 扩增长度540 bp.

1.2 方法

大鼠肝组织总RNA抽提, 操作步骤按说明书进行. 剪取50-100 mg肝组织加入Trizol试剂(美国Gibcol 公 司)溶液1 mL, 冰浴中彻底匀浆, 在匀浆后的样本中加入氯仿0.4 mL, 混匀, 冰置15 min后4 ℃12 000 g离心15 min. 取上清液, 加入等体积的异丙醇, 混匀, 放置10 min后4 ℃ 12 000 g离心10 min, 弃上清液, 加入75%乙醇1 mL, 混匀, 4 ℃ 7 500 g离心5 min, 弃去上清液. 紫外分光光度计于260 nm波长测定RNA含量. 然后按逆转录反应试剂盒操作程序进行逆转录合成cDNA. 取总RNA 4.5 g, 逆转录酶1 L, dNTP混合物(10 mmoL/L)2 L, olig dT-Adaptor 引物1 L, 10×PCR缓冲液2 L, MgCl2(25 mmol/L)4 L, RNA酶抑制剂0.5 L, 加无RNA酶水至总体积20 L. 反应条件: 30 ℃ 10 min, 42 ℃ 60 min, 99 ℃ 5 min, 5 ℃ 5 min, 合成cDNA. PCR扩增反应体系: dNTP混合物(10 mmoL/L) 0.5 L, 10×PCR缓冲液2 L, MgCl2(25 mmoL/L)1.2 L, Taq酶(5 MU/L)0.25 L, 上下游引物(20 mmol/L)各1 L, 逆转录cDNA产物2 L, 其余为无RNA酶水, 反应总体积20 L. TGF-β1扩增参数: 首先94 ℃预变性5 min; 然后94 ℃变性30 s, 61 ℃退火1 min, 72 ℃延伸45 s, 共35个循环, 最后72 ℃10 min以充分延伸. TIMP-1扩增参数: 首先94 ℃预变性5 min; 之后94 ℃变性 1 min; 退火56 ℃ 2 min; 延伸72 ℃1.5 min; 共35个循环, 最后72 ℃, 10 min, 终止反应. 分别以相同条件扩增鼠-actin, 作为内参照. 取15 L CR产物于15 g/L的琼脂糖凝胶电泳. 凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)检测DNA条带平均灰度值.

统计学处理 等级资料采用Ridit检验; 计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示, 两组均数比较用t检验.

2 结果

肝纤维化模型组大鼠毛色暗淡, 厌食, 消瘦, 尿色深黄, 死亡3只. 螺内酯组大鼠毛色较好, 食欲尚可, 质量较重, 死亡1只. 正常组大鼠一般情况良好, 无死亡.

2.1 肝纤维化程度

肝纤维化模型组10 wk时汇管区纤维组织增生, 伴明显的P-P桥(汇管区间的桥状纤维化)或P-C桥(汇管区-中央静脉间纤维组织增生)形成, 或可见结节形成. 螺内酯组肝纤维化程度低于模型组, 两组肝纤维化分级有显著性差异(P<0.05, 表1). 13 wk时, 肝纤维化模型组和螺内酯组均纤维组织增生明显, 肝纤维化分级两组无显著性差异 (P>0.05). 但螺内酯组仅有1只大鼠发生肝硬化, 而肝纤维化模型组则有3只. 肝硬化发生率有下降的趋势(表1, 图1.

表1 病理学改变.
t /wk分组n肝纤维化分级
0123456
10肝纤维化模型组60010023
螺内酯组a60021210
13肝纤维化模型组60000123
螺内酯组60013011
aP<0.05 vs 10 wk肝纤维化模型组.
图1
图1 肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1的表达. 1: 肝纤维化5级; 2: 肝纤维化3级; M: PCR marker.
2.2 TGFβ1和TIMP-1mRNA

肝纤维化时TGFβ1和TIMP-1 mRNA水平与正常组相比显著升高(P<0.05). 在10 wk时, 螺内酯组TGFβ1, TIMP-1 mRNA水平与肝纤维化模型组相比有下降的趋势, 但10及13 wk两组间表达均无显著性差异(表2; 图2-4).

表2 TGFβ1, TIMP-1mRNA的表达(mean±SD).
t/wk分组nTGF1TIMP-1
10肝纤维化模型组62.0 520±0.7 487a1.2 721±0.4 866a
螺内酯组61.3 939±0.3 526a1.0 044±0.2 101b
13肝纤维化模型组61.5 429±0.4 725a1.1 197±0.1 607b
螺内酯组62.1 679±0.7 825b1.2 262±0.1 452b
13正常组60.8 970±0.1 9800.5 986±0.1 157
aP<0.05 vs 正常组;
bP<0.01 vs 正常组.
图2
图2 肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1的表达. 1: 肝纤维化4级; 2 : 肝纤维化3级; M: PCR marker.
图3
图3 10 wk TGFβ1, TIMP-1 mRNA的表达. aP<0.05 vs 正常组; bP<0.01 vs 正常组.
图4
图4 13 wk TGFβ1, TIMP-1 mRNA的表达. aP<0.05 vs 正常组; bP<0.01 vs 正常组.
3 讨论

在实验性大鼠肝纤维化的发展过程中, 肝脏编码醛固酮合成酶的CYP11B2基因表达明显上调. 由于CYP11B2基因编码的是醛固酮合成后期阶段的关键酶, 因此, 提示醛固酮合成增加与肝纤维化的形成可能有密切关系. 原位杂交显示CYP11B2定位于肝星状细胞(HSC)内[26]. 在体外用无血清培养基培养原代HSC和HSC-T6细胞株, 同样能检测到CYP11B2mRNA的表达和醛固酮的合成[27]. 说明HSC表达和合成醛固酮. 进一步研究发现, 醛固酮可促进体外培养HSC-T6的Ⅰ, Ⅲ型前胶原mRNA的表达与胶原合成, 并对TIMP-1mRNA的表达也具有促进作用[28-29].

螺内酯作为醛固酮的拮抗剂, 可通过与醛固酮竞争性地结合受体, 以抑制醛固酮的作用.本结果显示, 在10 wk时, 螺内酯组大鼠的肝纤维化程度较模型组明显减轻, 具有统计学意义(P<0.05). 至13 wk时, 模型组有3只大鼠发生肝硬化, 而螺内酯组仅有1只. 从肝纤维化分级来看, 螺内酯组大多处于2级(1只)和3级(3只), 而模型组为4级(1只)和5级(2只). 虽然统计学处理二组之间无显著差异, 但螺内酯组肝硬化的发生率和肝纤维化程度均较模型组有下降趋势. 这可能与实验大鼠数量较少有关, 增加样本量有可能使这一趋势更加明确. 这表明螺内酯对CCl4诱导的肝纤维化, 特别是在早期具有一定的预防作用, 与文献[26]报道的一致.推测在肝纤维化早期, 肝组织中醛固酮的表达量可能相对较少, 因此螺内酯的拮抗作用较为明显, 以后随着病程发展, 醛固酮含量增多, 螺内酯的竞争性抑制作用被削弱. 研究发现[30], 随着肝纤维化的进展, 醛固酮的生成增加, 对此提供了证据.此外, 肝纤维化是一个由多种因素共同参与、相互作用的复杂过程, 醛固酮只是其中的因素之一. TGFβ1, TIMP-1在肝纤维化时表达显著增加, 但10及13 wk螺内酯组和模型组间表达均无显著性差异. 提示螺内酯对肝纤维化的抑制作用有可能不是通过直接抑制TGFβ1、TIMP-1的表达实现的.另外, 我们仅对TGFβ1, TIMP-1的转录水平进行了研究, 还没有观察两个分子在转录后蛋白质水平有无变化. 关于醛固酮对肝纤维化的作用及其机制, 目前尚未完全明了, 有待进一步深入研究.

编辑: N/A

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