丁型肝炎肝组织Bcl-2/Bax、Bak表达与细胞凋亡表达

摘要

目的: 探讨Bcl-2, Bax, Bak及肝细胞凋亡在丁型肝炎发病机制中的意义.

方法: 采用TUNEL技术和免疫组化单、双标记染色, 检测77例丁肝患者肝组织中HDAg, Bcl-2, Bax和Bak表达, 以及肝细胞凋亡表达. 同时以HDV阴性的67例乙型肝炎患者作对照.

结果: Bcl-2, Bax和Bak均以肝细胞质表达为主, HDAg以肝细胞核表达为主. HDAg, Bax和Bak与肝细胞凋亡表达及分布有相关性(t = 27.89, P<0.01, P<0.05 t = 19.16, P<0.05 t = 18.22), 四成分在各型肝炎中的表达强度有显著性差别意义(P<0.05).

结论: HDAg, Bax, Bak和肝细胞凋亡表达强度及阳性细胞分布均与肝组织炎症和病理损害程度相关, HDV感染可诱导肝细胞表达Bax和Bak, 增强肝细胞凋亡.

关键词: N/A

Expression of Bcl-2/Bax, Bak and hepatocytic apoptosis in tissues of patients with hepatitis D

Xiao-Hong Gu, Yun-Dong Zhang, Qi-Feng Li, Yu-Ming Wang

Xiao-Hong Gu, Department of Gastroenterolgy, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China.

Yun-Dong Zhang, Department of Neurosurgery, Daping Hospital Research Institute of Field Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China

Qi-Feng Li, Yu-Ming Wang, Infectious Disease Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Correspondence to: Xiao-Hong Gu, Department of Gastroenterolgy, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China. zhanggxh@cta.cq.cn

Received: August 8, 2003
Revised: January 10, 2004
Accepted: February 1, 2004
Published online: July 15, 2004

Abstract

AIM: To study the expression of Bcl-2, Bax, Bak and hepatocytic apoptosis in pathogenesis of hepatitis D.

METHODS: Expression of HDAg, Bcl-2, Bax, Bak and hepatocytic apoptosis in liver tissues of 77 patients with hepatitis D were studied by immunohistochemistry and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) technique. Meanwhile, the relationship between expression of HDAg, Bcl-2/Bax and hepatocytic apoptosis were studied by double labeling and serial sections.

RESULTS: Bcl-2 was mainly expressed in the cytoplasm of hepatocytes, Bax and Bak mainly in the cytoplasm of hepatocytes and partly in the nucleus of hepatocytes, and HDAg mainly in the nucleus of hepatocytes. Many HDAg and Bax or Bak positive cells were distributed among infiltrating lymophocytes at the periportal region especially at the advancing edges in the areas of piecemeal necrosis. Many apoptotic hepatocytes were found to locate near to positive cells of HDAg. There were positive correlations between degrees of HDAg expression, Bax or Bak expression, and hepatocytic apoptosis (t = 27.89, P < 0.01, P < 0.05 t = 19.16, P < 0.05 t = 18.22).

CONCLUSION: The distribution and expression of Bax, Bak, HDAg and hepatocytic apoptosis are significantly correlated with the activity of imflammation and the severity of the liver damage.

Key Words: N/A

0 引言

HBV感染者重叠感染丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)后, 其病情加重、病程慢性化和死亡率增高的机制尚不十分清楚. 病毒性肝炎时常伴有肝细胞凋亡和坏死. 为了解细胞凋亡因子Bcl-2/Bax, Bak及其介导的肝细胞凋亡在丁型肝炎病情重型化机制中的作用, 我们对丁型肝炎患者肝组织HDAg, Bcl-2/Bax, Bak及细胞凋亡表达进行了研究如下.

1 材料和方法

1.1 材料

西南医院1990-2002院丁型肝炎患者77例, 其中急性肝炎(AH) 8例, 轻度慢性肝炎 ( Mild-CH)17例, 中度慢性肝炎 (Mode-CH)23例, 重度慢性肝炎 (Seri-CH)16例, 重型肝炎(SH) 13例(急性重型肝炎1例、亚急性重型肝炎6例、慢性重型肝炎6例). 以67例HDV阴性乙型肝炎作对照, 其中AH 9例, Mild-CH 13例, Mode-CH 17例, Seri-CH18例, SH 10例(亚急性重型肝炎5例、慢性重型肝炎5例). 所有病例均经皮肝穿获得肝组织, 病理检查确诊, 诊断标准以2000年《病毒性肝炎防治方案》为依据. 兔抗人Bcl-2, Bax, Bak多克隆抗体为美国Zymed公司产品. 丁型肝炎多克隆抗体由本科自行选定的HDV合成肽抗原经免疫家兔制备. 免疫组化染色的过氧化酶标记的链霉卵白素(S-P)试剂盒, 为美国Maxin Biotech Inc产品. TUNEL试剂盒为德国 Boehringer Mannheim公司产品.

1.2 方法

操作步骤按说明书进行. 阳性对照为已知Bcl-2, Bax阳性肝癌组织切片, 阴性对照选自正常人肝组织, 其血清各型肝炎标志物均阴性. 此外, 分别用鼠血清和PBS代替第一抗体作替代实验. 每张切片先分别检测HDAg, Bcl-2, Bax, Bak和肝细胞凋亡. 免疫组化和细胞凋亡程度判断: 低倍镜视野阳性细胞少于1/3为(+), 2/3为(++), 大于2/3为(+++).

统计学处理 采用计数资料的x²检验和秩相关分析.

2 结果

2.1 肝细胞凋亡

凋亡肝细胞体积变小, 胞质收缩, 核固缩, 核呈月牙型, 或形成核膜疱, 致密染色质边聚(图1 A), 且可不伴有炎性细胞浸润. 各类丁型肝炎患者的肝细胞均有不同程度的凋亡, 凋亡细胞呈点或片簇状分布于肝小叶, 在门脉周围及坏死灶处较为密集, 科伴有炎症细胞浸润. 急性肝炎和轻度慢性肝炎组比较, 凋亡细胞的阳性程度无显著差异. 中、重度慢性肝炎和重型肝炎肝细胞凋亡表达明显强于前二者(P<0.05, 表1). 丁型肝炎肝胞凋亡表达强度及阳性率(96%, 74/77)略强于乙型肝炎(93%, 64/67), 但无统计学差异.

表1 丁型肝炎肝细胞凋亡和HDAg表达.

type	TUNLE				HDAg
	-	+	++	+++	+	++	+++
AH	1	6	1	0	6	2	0
Mild-CH	2	11	4	0	15	2	0
Mode-CH	0	4	16	3	7	10	6
Seri-CH	0	2	10	4	1	9	6
SH	0	1	5	7	0	7	6

Ridit分析, 以轻度慢性肝炎为标准组, 中、重度慢性肝炎和重型肝炎的R值(0.82、0.86和0.91)均大于0.5, P<0.05.

图1 丁型肝炎患者肝组织细胞凋亡和免疫组化检测. A: 肝细胞凋亡表达, TUNEL×1 000. B: 肝细胞HDAg表达, SP×200. C: 肝细胞bcl-2表达, SP×400.

2.2 HDAg表达

HDAg主以肝细胞核表达, 其次是胞质表达. 在坏死灶边缘肝细胞和气球样变性肝细胞质内有大量的HDAg呈浆型强阳性表达. 中、重度慢性肝炎和重型肝炎中HDAg阳性细胞呈弥散型、灶型或片簇状分布于肝小叶内, 在门脉周围和坏死灶处较密集(图1 B); 急性肝炎和轻度慢性肝炎HDAg阳性细胞多呈单个或小灶状稀疏分布于小叶内. 秩相关分析发现重型肝炎和慢性肝炎中、重度HDAg表达强于急性肝炎和轻度慢性肝炎(P<0.05, 表1).

2.3 Bcl-2, Bax和Bak表达

Bcl-2阳性率为35.1%(27/77), 以胞质表达为主, 可见核膜表达, 但未见核阳性表达. Bcl-2阳性细胞以散在分布为主, 也可有片状分布(图1C). 肝细胞坏死区少见Bcl-2阳性细胞, 在少数浸润的炎性细胞和胆小管细胞可见阳性表达. 结果显示, 急性肝炎和轻度慢性肝炎中Bcl-2的表达明显高于中、重度慢性肝炎和重型肝炎(P<0.05). 连续切片观察在坏死区及周围有较多凋亡细胞, 而Bcl-2在此区却少有阳性细胞. Bax和Bak阳性率分别为83.1%(64/77)、65.5%(54/77), 以胞质表达为主. 急性肝炎和轻度慢性肝炎中, 阳性细胞较少且分散, 表达强度也较弱; 中、重度慢性肝炎和重型肝炎中, 阳性细胞呈灶状或片簇状分布于肝小叶周边, 在门脉周围、碎屑状坏死区Bax, Bak表达尤为明显, 其表达较急性肝炎、轻度慢性肝炎组明显增强. 乙型肝炎肝组织中, Bax, Bak表达及阳性细胞分布基本与丁型肝炎的一致, 但片簇状较少见, 表达程度稍弱.

2.4 HDAg, Bcl-2, Bax和Bak表达与肝细胞凋亡的关系

双标记发现, 多数凋亡细胞位于HDAg阳性部位或其附近, 少数组织中二者无明显解剖学关系; 凋亡可发生于HDAg阳性细胞, 亦可发生在HDAg阴性细胞. 坏死区及其周围有较多凋亡细胞, 而Bcl-2在此区则很少有阳性信号. 但在TUNEL阳性的其他区域也可见Bcl-2阳性细胞. 与Bcl-2分布相反, Bax表达阳性区域与肝细胞凋亡表达和程度密切相关(图2, 表2).

表2 肝细胞HDAg, Bax, Bak表达与肝细胞凋亡的关系(n, c test).

TUNEL	HDAgb			Baxa				Back
	+ (n =29)	++ (n =30)	+++(n =18)	- (n =13)	+ (n =28)	++ (n =22)	+++ (n =14)	- (n =23)	+ (n =22)	++ (n =19)	+++ (n =13)
-	2	1	0	2	0	1	0	2	1	0	0
+	14	6	4	7	10	4	3	12	7	3	2
++	11	18	7	4	14	13	5	8	10	13	5
+++	2	5	7	0	4	4	6	1	4	3	6

^aP<0.05, t = 19.16,

^bP<0.01, t = 27.89, ^cP<0.05, t = 18.22.

图2 丁型肝炎患者肝细胞凋亡(红色)和bax(紫黑色)双标记表达,DS400.

3 讨论

细胞凋亡是机体在生长发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持体内环境平衡的自我调节机制. 细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制. 这种调节机制发生障碍和紊乱与多种疾病的发生、发展密切相关. 近年研究发现肝细胞凋亡在病毒性肝炎发病机制中有着重要作用. 细胞凋亡的强弱与患者病情的轻重直接相关. 线粒体功能改变是决定细胞死亡的关键因素, 而定位于线粒体膜的Bcl-2, Bax和Bak等蛋白可通过调节线粒体功能而制约细胞凋亡的发生[1-3].

无能在生理或病理条件下, Bcl-2为细胞凋亡过程中的一类重要的抑制基因, Bcl-2的高度表达可阻断细胞凋亡的发生, 延长细胞存活时间, 而不影响细胞增生, 并在多种正常细胞的激活和发育过程中表达, 而在成熟或走向凋亡的细胞不表达或低表达[4-6]. 已发现病毒编码蛋白与Bcl-2具有同源性, 可阻止细胞凋亡的发生, 有利病毒在宿主细胞内的长期潜伏, 在不出现细胞溶解坏死的情况下, 造成病毒的持续感染[7-8].

Bax, Bak为Bcl-2相关蛋白, 与Bcl-2的作用相反, 能加速细胞凋亡, Bcl-2表达水平较高时, 可形成Bcl-2和Bcl-2同源二聚体, 抑制细胞凋亡; Bax表达水平较高时, 则形成Bax和Bax同源二聚体, 加速细胞凋亡. Bax可与Bcl-2蛋白形成异二聚体并使之失活, 加强表达Bax形成同二聚体, 加速细胞凋亡, 因此Bcl-2和Bax二者间的比率影响着细胞的凋亡状况. Bak可直接抑制Bcl-2活性以促进细胞凋亡[4-5,7-9] .

Bcl-2蛋白在丁型肝炎的表达与乙型肝炎和正常人肝组织中的表达无统计学差别意义. 而Bax、Bak表达明显高于Bcl-2蛋白的表达, 中、重度慢性肝炎和重型肝炎中的表达强于急性肝炎和轻度慢性肝炎, 重型丁型肝炎中Bax, Bak表达强于重型乙型肝炎(P<0.05). 双标记检测发现HDAg与Bax, Bak表达及阳性细胞分布呈一致性. 对各型肝炎HDAg, Bcl-2和Bax, Bak表达强度分析发现, HDAg和Bax及肝细胞凋亡均与肝组织炎症活动和病理损害相关, 提示了丁型肝炎发病机制中HDAg, Bax, Bak和细胞凋亡的作用.

乙肝病毒对Bax蛋白表达可能有诱导作用, 对Bcl-2表达无明显影响, Bax参与了肝细胞损害过程[11,16]. 认为丁型肝炎中除了乙肝病毒抗原可诱导肝细胞表达多种促凋亡因子外, HDAg也有同样作用, 不仅可诱导Fas/FasL表达[10,16], 也可促进Bcl-2、Bax、Bak表达. 因此慢性乙肝患者或HBsAg携带者重叠 HDV 感染后, 乙肝病毒抗原和丁肝病毒抗原可同时促进多种促凋亡因子的表达, 增强宿主的免疫应答, 及肝组织中复制状态的HDV对肝细胞的直接细胞毒性作用[11-16], 一方面导致肝细胞凋亡, 被病毒感染的细胞随之被清除; 另一方面则导致大量肝细胞坏死, 加重病理损害, 病情恶化, 临床死亡率增高, 预后明显变差. 提示, 在丁型肝炎病情重型化机制中, 多种促凋亡因子介导的肝细胞凋亡可能起了一定的重要作用.

备注

编辑: N/A

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