不同HBV基因型HBV感染者的自身免疫现象

摘要

目的: 探讨乙型肝炎病毒不同基因型对肝炎病毒引发的机体自身免疫机制的影响.

方法: 选择HBV-DNA阳性HBV感染者87例, 其中无症状病毒携带者20例, 慢性乙肝24例, 慢性重型乙肝34例, 乙肝肝硬化9例. 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测HBV-DNA基因型. 采用间接免疫荧光法、金标法、放射免疫法、免疫乳胶凝集法分别检测所有研究对象的抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(Ads-DNA)、抗甲状腺球蛋白抗体及抗甲状腺微粒体抗体(TGA/TMA)、类风湿因子(RF).

结果: 87 例HBV-DNA阳性HBV感染者中, 基因型B 75例(86.2%), 基因型C12 例(13.8%), 未发现基因型A、D、E、F存在. 与正常对照组相比, HBV-DNA阳性HBV感染者自身抗体检出率明显增高, 有显著性差异(P<0.01). 75例B型HBV感染者中有51例检出59项次自身抗体, C型HBV感染者中12例有7例检出12项次自身抗体, 两组自身抗体检出率比较无统计学意义(P>0.05).

结论: 本地区存在HBV基因型B和基因型C, 且以B型为优势基因型, 未发现基因型A、D、E、 F存在. HBV感染可引发自身免疫性反应, 导致多种自身抗体的产生, 但基因型B和基因型C病毒感染者机体内自身免疫应答过程并无明显差异.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: February 14, 2004
Revised: February 20, 2004
Accepted: February 25, 2004
Published online: June 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

我国是慢性肝病的高发区[1-2], 病毒性肝炎占大多数[3-8], 严重威胁着人们的身体健康. 近年来在慢性肝炎患者血清中检测出各种自身抗体的研究报道日趋增多, 证实慢性肝炎患者体内发生了自身免疫反应[9-17]. 肝炎病毒感染后机体产生的自身免疫紊乱现象正日益受到重视. 目前基于全核苷酸序列比较, 乙型肝炎病毒(HBV)可分A、B、C、D、E、F、G、H8个基因型[18-19]. 有关在中国人HBV感染者中的不同HBV基因型对机体自身免疫机制影响的研究尚未见报道. 对HBV基因型与机体免疫机制紊乱关系的研究有助于深入探讨乙肝的发病机制, 有助于诊断、指导治疗及判断预后. 本文通过对不同HBV基因型HBV感染者的自身免疫紊乱现象的观察, 旨在探讨HBV基因型对机体免疫机制的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

HBV-DNA阳性HBV感染者87例, 系我科2003-01/08门诊和住院患者, 男52例, 女35例, 年龄13-68岁, 其中无症状病毒携带者20例, 慢性乙肝24例, 慢性重型乙肝34例, 乙肝肝硬化9例, 所有病例均符合2000年全国传染病寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的诊断分型标准[20]. 重叠有甲、丙、戊肝病毒感染, 及合并有其他严重疾病的患者均从研究对象中去除. 所有病例近3 mo内未使用免疫调节剂. 随机选择健康献血员24名作为正常对照, 均已除外肝炎病毒感染. 清晨采集受检者空腹静脉血4 mL, 分离血清, -20 ℃保存备用.

1.2 方法

1.2.1 HBV标志物的检测: 使用ELISA法检测血清HBV标志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb). 试剂盒购于洛阳华美生物工程公司. 严格按说明书操作, 结果由酶标仪测定.

1.2.2 HBV基因分型: 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测HBV-DNA基因型. 试剂盒购于上海申友生物技术有限公司和宝生物工程(大连)有限公司. 设计引物对: YS1(nt203-221:5'GCGGGTTTTTCTTGTTGA3')和YS2(nt788-769: 5'GGACTCAAGATGTTCTACAG3'). PCR扩增HBVS基因长度为585 bp. 方法: 将50 mL浓缩液与50 mL待测血清标本混匀, 8 000 rpm离心10 min, 弃掉上清液留下沉淀, 将10 mL裂解缓冲液与沉淀混匀, 振荡15 min. 开水浴10 min, 14 000 rpm离心15 min, 取上清液2 mL行PCR. PCR在Icycler仪(Bio-Rad, USA)中进行. PCR系统组成为: 待检上清液2 mL、TaKaRa Ex Taq酶(5 U/ mL) 0.25mL、10×Ex Taq Buffer(Mg plus) 5 mL、dNTP Mixture 4 mL、引物1、引物2各1 mL、灭菌蒸馏水36.75 mL, 共50 mL反应体积. 扩增条件: 95 ℃预变性300 s, 94 ℃变性60 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s, 共扩增35个循环. 扩增的靶基因经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定. 选用限制性内切酶StyI、BsrI分别消化已鉴定的PCR产物1 mL, 总反应体积为20 mL, 反应条件: StyI 36 ℃ 3 h、Bsr I 67 ℃ 3 h, 取消化产物8 mL于15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶染色后于紫外线下观察, 并根据不同的电泳图谱进行RFLP分析以确定HBV基因型.

1.2.3 自身抗体测定: (1)抗核抗体(ANA)测定采用间接免疫荧光法, 大鼠肝抗原片由本院免疫室制备, 羊抗人IgG荧光抗体购自卫生部上海生物制品研究所. 将待测血清用pH7.2PBS缓冲液按1:40、1:80、1:160、1:320稀释, 分别加入抗原基质片上, 内置37 ℃水浴箱孵育30 min, 取出放入染色缸中用PBS缓冲液清洗3次, 吸水纸吸干, 加入荧光抗体, 室温孵育30 min, PBS缓冲液洗片3次, 以甘油缓冲液封片, 荧光显微镜下观察. (2)抗双链DNA抗体(Ads-DNA)测定采用金标斑点渗滤法, 试剂购自福建三强生物技术公司. 将反应板回温到35 ℃, 滴加100 mL试剂B于反应孔中使其完全渗入. 滴加待测血清100 mL于反应孔中待完全渗入后再加入150 mL试剂A, 最后滴加100 mL试剂B于反应孔中, 2 min后观察结果. (3)抗甲状腺球蛋白抗体及抗甲状腺微粒体抗体(TGA/TMA)测定采用放射免疫法, 试剂购自卫生部上海生物制品研究所. 将¹²⁵Ⅰ-TG和¹²⁵Ⅰ-TM各100 mL分别加入T管和待测管, 加20 mL待测血清和200 mL缓冲液于待测管中, 然后将两管摇匀, 37 ℃孵育60 min, 再加入分离试剂TMAB、TGAB, 摇匀, 室温30 min, 3 500 rpm, 离心15 min, 吸上清夜, 测T管和待测管沉淀. (4)类风湿因子(RF)采用免疫乳胶凝集法测定, 试剂购自上海伊华医学科技有限公司. 将待测血清用生理盐水1:20稀释后, 加50 mL于玻璃板上, 滴加一滴胶乳试剂, 充分摇匀, 3 min后观察结果, 凝集为阳性.

统计学处理 计数资料以率表示, 采用χ²检验. 所有数据均在计算机中经SPSS10.0统计软件处理.

2 结果

2.1 HBV-DNA基因型分型标准及检测结果

限制性内切酶Sty I在C型第301位有酶切位点, 可鉴别98%C型, 被切成253 bp和332 bp两个片段; 内切酶BsrI在B型第174位有酶切位点, 被切成126 bp和459 bp两个片段, 可准确鉴定100%B基因型; 92%A型和100%E型第348位有BsrI酶切位点, 被切成285 bp及300 bp两个片段; 而C型、F型及95% D型无BsrI酶切位点. 经PCR检测出87 例HBV-DNA阳性患者, 男52 例, 女35 例; 进一步基因型分析, 发现基因型B 75例, 占86.2%, 基因型C12例, 占13.8%. 未发现基因型A、D、E、F存在.

2.2 乙肝患者与正常对照组自身抗体检出结果

87例HBV-DNA阳性病毒感染者有58例检出至少一种以上的自身抗体. 按检出例数计算自身抗体总检出率达66.7%, 显著高于正常对照组(P<0.01). 检出的自身抗体以ANA、RF多见, 滴度分布以低滴度为主(表1).

表1 HBV-DNA阳性乙肝患者与正常对照组自身抗体检出结果.

组别	n	总阳性率(%)	ANA	Ads-DNA	RF	TGA	TMA
正常对照组	24	5 (20.8)	5	0	0	1	2
HBV感染者	87	58 (66.7)	37	1	15	9	9

2.3 不同基因型HBV感染者自身抗体分布

基因型B组中有51例检出自身抗体(51/75), 基因型C组中有7例检出自身抗体(7/12), 两组自身抗体阳性率相比较无统计学意义(P>0.05 表2).

表2 不同基因型HBV感染者自身抗体分布.

组别	n	总阳性率(%)	ANA	Ads-DNA	RF	TGA	TMA
B型	75	51 (68.8)	32	1	13	7	6
C型	12	7 (58.3)	5	0	2	2	3

3 讨论

HBV感染的致病机制非常复杂. 目前认为HBV感染后的肝组织损伤并非HBV在肝细胞内复制繁殖直接作用的结果, 而是机体一系列免疫反应造成肝细胞的病理性免疫损害. 这种乙肝免疫损伤包括细胞介导的免疫损伤、免疫复合物引起的免疫损伤及自身免疫反应引起的免疫损伤. 自身免疫是针对自身成分的抗体或细胞性免疫效应的现象, 是机体对自身组织成分的免疫应答过于亢进的表现. 本文研究发现在HBV感染者血清中可检出多种自身抗体, 且与正常人比较有显著性差异(P<0.01), 结果证实HBV感染与自身免疫密切相关.

基于全核苷酸序列比较, 乙型肝炎病毒(HBV)可分A、B、C、D、E、F、G、H8个基因型. 基因型反映了HBV自然感染过程中的变异特点, 是病毒变异进化的结果. HBV基因分型方法目前有3种: (1)病毒基因组或S基因序列测^序[21]; (2)单克隆酶联抗体免疫黏附法[22]; (3)聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)[23-24]. HBV基因型的地理分布有一定的区域^性[25]. 我国HBV基因型南方以B型为主, 北方以C型为主, D型仅见于西部及少数民族地区, 还未发现其他型别. 也有学者研究发现D基因型在我国宁夏地区、广东地区和香港地区约占感染者的15%, 因而HBV基因型在我国的确切分布状况仍不十分清楚[26]. 本研究采用PCR-RFLP进行HBV基因型鉴定[27], 在87 例HBV-DNA阳性病毒感染者中发现基因型B为优势基因型 75例(87.4%), 基因型C12例(12.6 %), 未发现基因型A、D、E、F存在. 结果与文献[28]报道基本一致.

近年有文献[29]报道HBV基因型与疾病的活动及病毒复制存在一定关系. 本研究首次检测了我国不同HBV基因型HBV感染者血清中的自身免疫性抗体, 发现基因型B组中有51例检出自身抗体(51/75), 基因型C组中有7例检出自身抗体(7/12), 两组自身抗体阳性率无统计学意义(P>0.05). 结果提示感染HBV基因型B和基因型C的患者机体内自身免疫应答过程并无明显差异, 即基因型B和基因型C对HBV感染引发的自身免疫反应并无影响. 本研究的血清标本未发现A、D、F、E基因型, 难以对这几型自身抗体检出率进行比较. HBV不同基因型对肝炎病毒引发的机体自身免疫机制是否存在一定的影响, 尚有待于进一步积累病例深入研究.

备注

$[Footnotes]

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