研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-06-15; 12(6): 1464-1465
在线出版日期: 2004-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i6.1464
实时荧光定量PCR检测血清中HCV-RNA
张淑云, 刘伟, 谷鸿喜, 杜博, 常曼丽
张淑云, 刘伟, 杜博, 常曼丽, 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心 黑龙江省哈尔滨市 150086
谷鸿喜, 哈尔滨医科大学微生物学教研室 黑龙江省哈尔滨市 150086
通讯作者: 张淑云, 150086, 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路247号, 哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心. dongguanglu@0451.com
电话: 0451-86605743
收稿日期: 2004-03-05
修回日期: 2004-03-10
接受日期: 2004-03-16
在线出版日期: 2004-06-15

目的: 通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与逆转录PCR(RT-PCR)两种方法检测血清HCV-RNA的结果比较, 评价FQ-PCR法的临床应用价值.

方法: 样本为经ELISA法筛选抗HCV阳性血清401份, 其中221份采用实时荧光定量PCR法检测, 180份采用RT-PCR法检测.

结果: FQ-PCR法检测HCV-RNA, 阳性率(≥102拷贝/mL)68.3% (151/221), 定量范围在102-107拷贝/mL之间, 但≤106拷贝/ml占98.1%(148/151); RT-PCR法检测阳性率为30%(54/180).

结论: FQ-PCR检测HCV-RNA较RT-PCR是一种省时、简便、敏感、特异和防污染的体外基因扩增与定量检测方法, 其结果对临床诊断和疗效观察有重要的指导意义.

关键词: N/A
引文著录: 张淑云, 刘伟, 谷鸿喜, 杜博, 常曼丽. 实时荧光定量PCR检测血清中HCV-RNA. 世界华人消化杂志 2004; 12(6): 1464-1465
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 5, 2004
Revised: March 10, 2004
Accepted: March 16, 2004
Published online: June 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是近几年发展起来的一种核酸定量检测技术. FQ-PCR以其快速简便、定量和防污染等优点很快被临床应用[1], 但其检测结果的临床应用价值尚需进一步认识. 为了探讨其在检测丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)中的意义, 我们对180例采用逆转录PCR(RT-PCR)和221例采用FQ-PCR进行HCV-RNA检测的结果进行了分析和比较, 现报告如下.

1 材料和方法
1.1 材料

1999-12/2003-05来我院门诊就诊, 并经ELISA法筛选抗-HCV阳性患者的血清401份; RT-PCR法是使用北京人民医院肝病研究所提供的HCV RNA检测试剂盒和美国PE公司基因扩增仪(PE480); FQ-PCR是采用深圳匹基生物工程股份有限公司HCV RNA荧光定量检测试剂盒(一步法)和罗氏公司荧光定量PCR仪.

1.2 方法

按就诊时间分两组, 前180份标本采用了RT-PCR法检测, 后221份采用的是FQ-PCR法检测.实验操作和结果分析均严格按说明书进行.

统计学处理 采用SPSS10.0系统分析软件进行数据处理, 两组率的比较采用χ2检验.

2 结果
2.1 RT-PCR扩增结果

RT-PCR扩增产物经20 g/L琼脂糖 凝胶电泳, 于180 bp处出现特异性核酸条带为HCV RNA阳性(图1).

图1
图1 RT-PCR扩增HCV RNA电泳. 1, 8为MpUC19DNA/Msp相对分子质量标准; 2为阴性对照; 3, 4, 5, 6为阳性标本.
2.2 FQ-PCR结果

2.2.1 FQ-PCR阳性标准曲线: HCV定量阳性标准品(HCV-RNA质粒)经FQ-PCR测定, 以起始浓度的对数值为横坐标, 以PCR扩增的循环域值(CT)为纵坐标, 可以得到一条直线型标准曲线(图2), 相关系数r = -0.998, 斜率为-3.558.

图2
图2 HCV-RNA的FQ-PCR定量标准曲线.

2.2.2 HCV-RNA的定量及其范围: FQ-PCR法检测221份血清, HCV-RNA≥102拷贝/mL占68.3%(151/221), 定量范围在102-107拷贝/mL之间;阳性分布主要在106拷贝/mL及其以下,占98.1%(148/151)(表1).

表1 FQ-PCR法检测221份血清中HCV-RNA的含量分布.
HCV-RNA的含量n百分率(%)
<1027031.7
102-219.5
103-3716.7
104-2611.8
105-4018.1
106-2410.8
107-31.4
合计221100

2.2.3 FQ-PCR与RT-PCR结果比较: FQ-PCR法检测血清中HCV-RNA阳性率为68.3%, 而常规RT-PCR法阳性率为30%, 二者差异显著(χ2 = 58.3, P<0.01, 表2); FQ-PCR法操作时间(3-4 h)短于RT-PCR法(5-6 h).

表2 两种不同方法检测血清中HCV-RNA结果比较.
方法n阳性份数阳性率(%)
FQ-PCR22115168.3
RT-PCR1805430
χ2 = 58.3, P<0.01.
3 讨论

目前抗HCV仍然是临床诊断HCV感染的主要手段, 但存在多方面的局限性[2-3]. 常规RT-PCR及其他许多PCR法虽能反映体内病毒存在, 也提高了HCV检测的灵敏度和特异性, 但不能准确定量及动态观察病毒水平的变化, 并有PCR产物污染的可能[4-6]. FQ-PCR技术是在PCR过程中引入了特异性荧光探针杂交和光学检测技术, 不仅提高了PCR扩增的特异性和检测的灵敏度, 而且通过荧光共振能量迁移(FRET)原理、循环域值(CT值)的设定和CT-浓度标准曲线, 实现了PCR起始模板的准确定量和在线监测PCR全过程. 本研究用FQ-PCR法检测了血清中HCV-RNA的含量, 定量可低至102和高达107拷贝/mL, 阳性率68.3%, 显著高于RT-PCR法(30%), 与文献[7-8]报道基本一致, 反映了该方法可定量和敏感的特点.测定的HCV-RNA水平98.1%在106拷贝/mL或以下, 与乙肝病毒(HBV)在体内的高含量(106-108拷贝/mL)相比相对较低[9], 进一步证实了文献报道的HCV在体内的复制水平相对较低的特点[10-11]. 本检测和程刚et al[3]的报道均显示FQ-PCR法检测HCV-RNA的定量范围较宽, HCV-RNA:102-107拷贝/mL, 因而在用药前后及用药过程中采集多份标本进行检测, 即动态观察HCV-RNA水平的变化, 可以很好地反映药物的疗效. 另外, 在FQ-PCR操作中, 只需一次加样即可完成HCV-RNA的逆转录、扩增和定量, 一次检测只需3-4 h, 与RT-PCR相比, 具有方便、省时、快捷, 有效解决PCR污染问题和自动化程度高等特点. 总之, FQ-PCR法检测HCV-RNA较RT-PCR法敏感, 且能定量, 能动态观察HCV-RNA水平的变化, 可为了解丙型肝炎病毒体内复制情况及诊断、选择治疗方案和评估药物疗效等提供较可靠的依据. 但FQ-PCR法也存在所需仪器昂贵、检测费用高等缺点, 有待进一步改进.

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