修回日期: 2004-02-09
接受日期: 2004-05-09
在线出版日期: 2004-06-15
大肠癌的免疫基因治疗作为手术和放化疗的辅助治疗手段有重要的意义. 选择编码细胞因子或其受体为目的基因导入肿瘤细胞或免疫效应细胞, 在肿瘤局部产生高分泌量的细胞因子, 激活抗肿瘤免疫反应, 使肿瘤的生长受到抑制或坏死消退, 克服了直接给药的严重毒副作用. 将肿瘤特异性转录调控序列(如启动子或增强子)与细胞因子基因连接并转染细胞, 驱动的目的基因, 增强基因治疗的靶向性, 做到有的放矢, 可达到特异性治疗的目的．常见用于大肠癌基因治疗的细胞因子基因有IFN(干扰素)基因、TNF(肿瘤坏死因子)基因、IL(白介素)基因家族、CSF(集落刺激因子)基因家族、IGFR(胰岛素样生长因子受体)基因等．将多种基因联合应用, 或细胞因子基因与其他治疗手段相联合可以提高抗肿瘤效应, 减少毒性
引文著录: 王艳, 李岩. 大肠癌细胞因子基因治疗的研究现状. 世界华人消化杂志 2004; 12(6): 1445-1450
Revised: February 9, 2004
Accepted: May 9, 2004
Published online: June 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(6): 1445-1450
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i6/1445.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i6.1445
大肠癌是常见的恶性肿瘤, 传统的手术、化疗、放疗等治疗方式已取得很大进展, 但均未能使其疗效得到明显的提高, 术后易复发及肝转移, 5年生存率<30%. 近年来, 随着分子生物学及基因工程的发展, 基因治疗已成为肿瘤治疗的研究重点, 其中细胞因子基因治疗因其简单、安全、有效成为大肠癌的基因治疗中较为常用的, 且具有临床应用潜力的治疗策略. 选择编码细胞因子或其受体为目的基因, 将其导入肿瘤细胞或免疫效应细胞, 在肿瘤局部产生高分泌量的细胞因子, 可使肿瘤细胞从无、弱免疫原性变为强免疫原性, 从而激活或增强机体的特异性抗肿瘤免疫反应, 使肿瘤的生长受到抑制或坏死消退, 达到抗肿瘤的目的, 克服了以往细胞因子直接给药及反复、多次应用所产生的严重毒副作用等缺点, 并取得了更明显的治疗效果, 有不少已进入临床试验阶段[1-2]. 本文将就近年来大肠癌细胞因子基因治疗的国内外研究进展做一综述. 细胞因子是指由免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的一组异质性多态调节因子, 具有广泛的生物学功能, 参与机体的多种生理和病理过程, 在介导机体多种免疫反应, 如肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫等过程中发挥重要作用. 细胞因子的作用具有多向性、网络性的特点, 他们不仅可以单独发挥生物学作用, 而且不同的细胞之间还可以相互协同或制约. 细胞因子的抗癌机制可概括为以下几个方面: (1)直接调节肿瘤细胞的生长和分化; (2)对肿瘤细胞的毒性作用; (3)作用于肿瘤的血管和营养系统的关系来影响宿主/肿瘤的关系; (4)激发宿主对肿瘤的免疫反应, 如IL-2可激活LAK细胞; (5)刺激造血功能, 促进骨髓恢复[3]. 外源性细胞因子已经广泛应用于肿瘤的临床治疗, 但他存在着大量使用后机体产生发热、过敏等毒副反应及由于机体产生相应抗体而降低其效价等不利因素, 使其大量使用受到限制[4]. 将某些细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-g、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等)的基因转染到肿瘤细胞或免疫细胞(如TIL、LAK细胞 及细胞毒淋巴细胞)中, 以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力.
将细胞因子基因导入肿瘤浸润淋巴细胞(TILS)或肿瘤特异性杀伤细胞(如LAK, CTL, 巨噬细胞等), 再将这些转基因免疫活性细胞回输入荷瘤宿主, 就能选择性聚集在肿瘤组织中, 产生细胞因子, 提高局部细胞因子水平, 使转基因免疫活性细胞发挥较强的抗肿瘤效应. 从理论上讲, 该方法是目前最为理想的一种过继性细胞免疫治疗方法. 但实践证明, 该方法治疗效果不尽人意, 存在明显的局限性, 主要表现在转基因免疫活性细胞在体内靶向性差, 存活时间短[5], 目前这种方法很少用于大肠癌的基因治疗.
向肌肉、瘤体内或腹腔内直接注射携带细胞因子的质粒或裸基因, 或体内注射携带细胞因子基因的腺病毒或痘苗病毒等. 其中IL-2基因腹腔注射治疗结肠癌肝转移的研究较多, 有的学者将IL-2DNA直接注入荷瘤小鼠腹腔, 结果发现肿瘤体积缩小, 小鼠存活期延长.
成纤维细胞易于获取和体外培养, 生命周期较长, 适于基因转移, 移植后可在体内长期存活, 且分泌细胞因子稳定, 临床应用安全可靠. Fakharai et al[6-7]将IL-2基因转染成纤维细胞导入鼠结肠癌动物模型CT-26, 24 h分泌IL-2达100 u, 能明显抑制结肠癌肝转移, 而且这种作用是由细胞毒性T淋巴细胞介导的. 树突状细胞(DC细胞)是体内最强的抗原递呈细胞, 具有很强的捕获和加工抗原的能力, 而且含有高水平的MHC分子、共刺激分子和黏附分子等. 将细胞因子基因导入DC细胞制备成DC疫苗诱导抗肿瘤免疫引起人们极大的关注, 近年来国内外的研究也较多[8-9].
组织特异性基因疗法, 即将肿瘤特异性启动基因与细胞因子基因连接并转染细胞, 这样该系统只在含有必需转录因子的特定肿瘤细胞中表达, 不侵犯正常细胞, 最理想的是将目的基因导入正在分裂的肿瘤细胞, 能准确地杀伤肿瘤细胞, 保护正常组织, 减少毒副作用, 提高靶向性[10]. 近年来, 找到一种更加灵活、更具广泛意义的方法, 即选用肿瘤特异性的调控元件(启动子或增强子)以驱动目的基因表达于特定的靶细胞. 常用于胃肠道的特异性调控元件是癌+胚抗原启动子(pCEA), 此外还有Vilin、erb-B2等. 其原理是非肿瘤细胞没有特定的转录激活因子, 因而不能转录出特定的mRNA, 因此就不能表达出相应的蛋白, 而肿瘤细胞则具有该转录因子活性, 能激活特定蛋白的表达, 其转录激活作用又是通过结构基因上游的调控元件(启动子或增强子序列)而起作用的. 因此, 在正常细胞和肿瘤细胞都被转染的情况下, 当用该调控元件驱动目的基因时, 肿瘤细胞会特异的表达出目的基因的活性, 而正常细胞则不能.
CEA在90%以上的结肠肿物中均有表达, 利用CEA转录调控序列构建肿瘤特异性调控元件(启动子或增强子)驱动的目的基因, 增强基因治疗的靶向性, 做到有的放矢, 从而大大提高肿瘤基因治疗的疗效, 减少治疗的不利因素. CEA基因启动子调控的大肠癌的自杀因子基因表达质粒转染大肠癌细胞株, 使大肠癌细胞对前药的敏感性提高了2 000倍, 显示了CEA启动子基因调控在提高大肠癌基因治疗的特异性上的优越性, 这种靶向性化疗是近年来的研究热点[11-12]. 该疗法以主动性免疫治疗为基础, 即将细胞因子基因转染入肿瘤细胞中, 制备出免疫原性更强的新型瘤苗, 以激发机体产生显著的抗肿瘤免疫功能从而达到治疗肿瘤的目的. Pervin et al[13]报道用CEA抗独特型抗体作为疫苗可产生相应的抗体和激发特异的T细胞反应. 1992年Kaufman et al[14]自人大肠癌细胞文库中克隆了编码CEA cDNA基因, 制成病毒疫苗接种小鼠, 结果可诱导小鼠产生针对CEA的体液和细胞免疫反应. Cao et al[15-18]克隆了人CEA启动子的核心区, CEA启动子有严格的大肠癌特异性和表达持久性, 活性高于SV40启动子.
研究新型、有效的肿瘤疫苗是近年来肿瘤免疫治疗的热点之一, 将细胞因子基因转导入肿瘤细胞制备成新型肿瘤疫苗是很有前景的课题. 但制备自体肿瘤疫苗既昂贵又费时费力, 而且不是所有的原发肿瘤细胞都能增生至足够的数量以用于制备肿瘤疫苗. 一种替代方法是将基因转导的肿瘤细胞系作为疫苗, 患者肿瘤细胞和疫苗细胞系的共同抗原是免疫应答的靶抗原, 肿瘤抗原是由与患者的MHC分子相关的APC递呈给T细胞, 因此, 患者与疫苗之间的MHC相容性并非必要. 常规的肿瘤疫苗采用灭活的肿瘤细胞, 目前常采用X或g射线照射、60Co照射、反复冻融、丝裂霉素等.
近年来关于肿瘤核酸疫苗的研究较为深入, 所谓核酸疫苗, 就是把外源基因连接到真核质粒表达载体上, 然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内, 使外源基因在活体内表达, 产生的抗原激活机体的免疫系统引发免疫反应. 与传统的基因治疗相比, DNA疫苗制备简便、安全长效, 可组建多价疫苗并可兼做预防和治疗性疫苗. 同时, 由于DNA免疫可以打破机体对CEA的免疫耐受, 因而可能具有比传统免疫基因治疗更强的肿瘤杀伤作用. 现在, 核酸疫苗免疫技术越来越受到人们的重视, 并被看作是继传统疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第3代疫苗. 研究发现人CEA-DNA疫苗可以激发CEA特异的体液和细胞免疫反应, 表现为可抵抗同源表达CEA结肠癌细胞的再接种[19-20].
John Wayne癌症研究所用另一种方法制备肿瘤疫苗, 即经过照射的肿瘤细胞与卡介苗(BCG)相结合, 卡介苗具有强烈的全身免疫刺激特性. Intracel公司的结肠癌疫苗Oncovax由自身癌细胞与BCG融合而成, 已完成Ⅲ期试验, 目前正在美国申请上市. 美国免疫应答公司把三个肿瘤细胞系和分泌白介素2(IL-2)的成纤维细胞相结合以增强免疫应答, 用于治疗结肠癌. 另一种增强对肿瘤抗原的免疫应答的方法是把抗原置于病毒中, 采用标准的、高度免疫原性的和容易操作的病毒, 用基因工程方法使他表达特异性肿瘤抗原. Therion公司还研制了携带癌胚抗原(CEA)的重组病毒用于治疗结肠癌.
目前在实验室研究中已经转染入肿瘤细胞的细胞因子有IL-2、IL-4、IL-6、B7、IFN-r、GM-CSF、IL-12、IL-15、IL-18等[21-22]. 其中IL-15、IL-18是近年来才开始研究的细胞因子. 据报道, IL-15转染瘤苗可以提高人类T细胞对抗原的反应. IL-18转染瘤苗可能通过CD4＋T细胞和NK细胞引起潜在抗瘤效应, 并发现此途径不同于IL-12和IFN-r的途径. 对细胞因子转染瘤苗的众多研究中显示IL-12和IL-2抑制局部肿瘤形成的作用最强, 而GM-CSF是至今为止所评价的33个基因产物中效力最强的. (2)增强肿瘤的免疫原性: 通过表达MHC分子、转染肿瘤抗原、表达某些肿瘤细胞所缺失的共刺激分子来增强肿瘤的免疫原性. 实验证明通过转染MHC分子可以增加MHC限制性肿瘤特异性抗原的表达, 从而增加CD4＋T细胞的活化. 目前研究表明共转染B7和MHCⅡ基因可以弥补激活途径中须有B7参与的要求, 从而相互协同增强免疫原性和抗瘤能力. B7基因导入具有肿瘤抗原的肿瘤细胞后还可以诱导机体打破肿瘤耐受状态, 获得针对B7-1的原发肿瘤的抑制作用. 并且新近研究还发现INF-r可以促使瘤细胞表面HLAⅠ类分子的表达显著提高, 且其HLAⅠ类分子的专一位点A2表达的增强与HLAⅠ类分子总体增加一致, 从而为免疫反应中的监测提供了途径. 与肿瘤发生有关的抗原基因的导入也可以增强其免疫原性. 目前研究较多的有CEA、AFP、MART-1或gp100. (3)基因产物可以直接杀伤瘤细胞.
基因载体可分为两大类: 病毒载体和非病毒载体. 病毒作为载体是经过改建的、缺失某些结构蛋白的重组体, 即所谓复制缺陷病毒. 常用的有逆转录病毒、腺病毒等, 转染效率高, 可稳定地整合到宿主基因组. 非病毒载体有脂质体、多聚阳离子载体等. 此外, 现在还有很多方法直接导入外源基因, 如DNA直接注射法、基因枪、磷酸钙沉淀法等[23]. 比较而言, 非病毒载体较为安全, 但转染效率较低而且价格昂贵.
IFN可分为a、b和g. IFNa、b有广谱抗病毒作用 , 促进多种细胞MHC类分子的表达, 提高巨噬细胞、NK细胞、CTL的抗肿瘤作用. IFN-γ可上调多种细胞MHCⅠ、Ⅱ类分子表达. IFN可抑制肿瘤细胞增生, 协同IL-2增强LAK活性, 上调瘤细胞上的MHCⅠ类分子表达, 增强瘤细胞对杀伤细胞的敏感性[24]. Hiroishi et al[25]联合CD80和IFN-α基因导入MC-38结肠癌细胞, 发现导入CD80和IFN-α的MC38细胞与野生型MC38(MC38-WT)细胞相比, 细胞毒性明显增强. 并能诱导鼠脾脏产生针对MC38的特殊的CD8+CTL细胞. 体外MC38-IFN-α和MC38-CD80较MC38-WT明显诱导CD8+CTL增生(P<0.05＝CD8+CTL的凋亡下降, 并发挥抗肿瘤效应. Sabaawy et al[26]用逆转录病毒介导IFN-α基因到结肠癌细胞系COLO201和NIH3T3中, 发现肿瘤细胞的增生和分化都被明显抑制, 且转导IFN-α基因的结肠癌细胞对5-FU的敏感性增加, 抗药性减低. Qin et al[27]利用复制缺陷型逆转录病毒载体介导IFN-b基因转染接种结肠癌细胞的免疫缺陷小鼠体内, 发现仅有1%出现肿瘤生长, 决大多数小鼠的肿瘤细胞完全消退.
TNF-α又称为恶质素, TNF-b又称为淋巴毒素. TNF在体内、外均能杀死某些肿瘤细胞, 或抑制其增生, 激活免疫细胞攻击肿瘤, 增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞的增生能力, 促进IL-2、CSF、IFN-γ等淋巴因子产生, 干扰肿瘤血液供应. 此外约50%的肿瘤本身可产生TNF, 这种内源性TNF可改变肿瘤对外源性TNF的敏感性[28]. Sato et al[29]用TNF基因转导自身肿瘤细胞, 他们从12例中胃肠道癌肿瘤渗出液中建立起原代培养肿瘤细胞株, 使用逆转录病毒载体MFG-TNF把TNF基因转导给肿瘤细胞株, 12例患者中10例TNF量在72 h内每106 个细胞达0. 3-3. 5 KU/L, 另外2个转导细胞株至少有1个TNF基因拷贝. Taniguchi et al[30]将TNF 基因转导结肠癌细胞后产生轻、中度抗肿瘤性, 同时静脉给予重组IL-12(rIL-12)则可见明显的疗效, 甚至使肿瘤消失. Walther et al[31]将TNF-α基因转染结肠癌细胞系LoVo(对外源性TNF敏感)和LS-174T(对外源性TNF耐受), 经转导产生TNF的癌细胞与亲本细胞相比具有显著的形态学变化, 软琼脂集落形成减少, 裸鼠皮下注射1×106的转导后表达TNF的肿瘤细胞, 其成瘤性减弱, 肿瘤生长缓慢. 结肠癌中TNF受体的表达较低. Isobe et al[32]将TNFα受体基因(TNFR-55后TNFR-75基因)插入逆转录病毒载体并转染包装细胞系, 产生了高表达TNFR-55和TNFR-75的高滴度的病毒转染产物, 这两种受体能与TNF稳定结合, 使转染的肿瘤细胞更易于被重组的TNF杀伤.
目前已发现和命名的IL有20种, 其中IL-2、4、6、7、12、15、18在抗肿瘤免疫和辅助肿瘤治疗中具有重要作用. 将IL-2基因导入小鼠C-26结肠癌细胞内, 发现在导入基因7-10 d后有76%的小鼠其肿瘤完全消退[33]. Gunji et al[34]将IL-2基因导入小鼠C-26结肠细胞内发现能明显增加小鼠的存活率. Mendiratta et al[35]将重组子IL-12基因和PVP(聚乙烯吡咯婉酮)转染结肠癌细胞CT26, 并移植裸鼠皮下, 发现瘤体和淋巴结中有CD4+、CD8+T细胞和NK细胞, 并表达MHCⅠ分子, 以CD8+T细胞为主的细胞参与了主要的抗肿瘤免疫反应. 50%的荷瘤鼠转染IL-12/PVP后, 肿瘤停止生长, 用野生型的CT26细胞再次接种到该鼠身上, 未见肿瘤生长. Mazzolini et al[36] 应用CT26结肠癌肝转移裸鼠模型, 导入重组免疫缺陷病毒IL-12 (ADCMVIL-12), 亦发现以CD8+为主的抗肿瘤免疫反应, 肿瘤明显消退. Xiao et al[37]用逆转录病毒将人IL-6 cDNA导入结肠癌HT-29细胞, 癌细胞抑制率达50%, 接种HT-29/IL-6细胞的裸鼠瘤体小于对照组, 用病毒上清液治疗, 可抑制肿瘤的生长.
最新命名的IL-23是IL家族的新成员, Wang et al[38]将IL-23基因转染结肠癌Colon26细胞, 分别接种到裸鼠和免疫力正常的鼠, 发现肿瘤的生长明显减弱, 甚至消失. 进一步研究发现Colon26/IL-23鼠的脾细胞分泌的IFN-γ明显增加, T细胞性介导的抗肿瘤免疫力增强. Satoh K将IL-12基因导入树突状细胞[39], 对结肠癌肝转移有明显治疗效果.
由于单一细胞因子基因治疗效果的不确定性, 以及大量表达对机体的毒副作用, 人们试将多种基因联合应用, 或细胞因子基因与其他治疗手段相联合以提高抗肿瘤效应, 减少毒性.
如IL-2+IL-12, IL-12+B7, IL-2+TNF, IL-12+IFN, IL-2+TNF+MHC-Ⅰ等联合治疗肿瘤的报道较多[46-48]. Lechanteur et al观察了一个鼠结肠癌腹腔广泛转移的动物模型, 将转导了IL-12基因和GM-CSF基因的鼠结肠癌细胞DHD/K12细胞腹腔注射后, 腹腔肿瘤的数目明显减少, 肿瘤的生长受阻, 延缓, 甚至停滞, 小鼠的生存率提高. 如果将转染后的DHD/K12细胞照射, 则不能表达IL-12和GM-CSF, 照射后的DHD/K12细胞腹腔注入, 其抗肿瘤性消失. 同时发现, 转染IL-12基因和GM-CSF基因能唤起其他肿瘤细胞和机体的抗肿瘤免疫反应, 这种抗肿瘤的免疫反应是由细胞毒性T淋巴细胞介导的. Stein et al[49]利用TNF基因联合IL-2基因转导人大肠癌细胞株HCT-15、HCT-16, 发现可使大肠癌耐药基因(mdrI基因)的表达明显下降, 对化疗药物的敏感性大大提高.
自杀基因是编码某些特殊酶的基因, 导入肿瘤细胞后可使无毒的前药转变为有活性的毒物, 引起靶细胞死亡. 将自杀基因与细胞因子基因联合应用, 可以取长补短, 提高治疗效果. 一方面, 自杀基因的表达可以直接杀伤一部分肿瘤细胞, 消除肿瘤负荷; 另一方面, 细胞因子基因的表达可以激发机体的抗肿瘤免疫功能[50-52]. IL-2基因与自杀基因联合治疗大肠癌的报道较多, 可协同增强抗肿瘤的效应. Chen et al[53]对小鼠结肠癌肝转移的模型通过重组腺病毒载体分别转导ADV/RSV-M IL-2基因和ADV-RSV-TK基因, 然后给予GCV治疗. 实验证明分别用IL-2基因, TK基因和两者联合治疗的肿瘤面积分别为120 m2、25 m2和5 m2, 并发现抗肿瘤效果的提高与IL-2介导的T细胞免疫增强有关. 在此基础上, Chen et al[54]应用HSV-TK(单纯疱疹病毒腺苷激酶基因)、IL-2基因和GM-CSF基因联合治疗结肠癌肝转移荷瘤小鼠, 结果显示联合自杀基因和两种细胞因子基因治疗优于TK基因和IL-2基因的单独治疗和联合治疗. 将IL-12基因与IFN-α基因分别导入鼠结肠癌细胞MC38, 注射给小鼠, 发现MC38/IFN-α的抗肿瘤作用强于MC38/12, 同时应用MC38/IFN-α和 MC38/IL-12则效果比单独应用MC38/IFN-α效果更好, 说明IL-12与IFN 基因具有协同抗肿瘤作用. Coll et al[55]利用HSV-TK-GCV方法联合IL-2基因治疗接种了DHDProB结肠癌细胞的BDIX小鼠, 结果有60%的小鼠完全治愈.
Sabaawy et al[56]将逆转录病毒介导的IFN-α基因转导入结肠癌细胞株C201中, 同时给予5-FU, 结果对5-FU的敏感性增加, 抗药性减低, 疗效提高1.5-2.1倍. 细胞因子基因治疗的同时给予化疗药物或进行放疗, 亦可起到协同作用. 另外, 可在细胞因子基因治疗的同时给予外源的重组细胞因子, 可减少重组细胞因子的用量及毒副作用
由于机体的免疫反应是有众多细胞因子参与, 经过多种信号识别、传导的复杂应答过程, 目前尚难以找到一种或几种细胞因子基因可以全面调动免疫系统并彻底消除肿瘤. 其次, 细胞因子存在双重性问题, 即有些细胞因子不但不能消除肿瘤, 而且能促进肿瘤的生长. 另外, 部分细胞因子本身的作用机制尚远未清楚, 故细胞因子基因的治疗实验研究还有很多地方还有待于发展和深入. 目前技术上的困难主要有如何提高基因转导进入肿瘤细胞的效率, 如何提高基因转导的靶向性, 如何为复杂的目的基因提供容量大且安全、有效、廉价的载体以及载体的制备问题. 大肠癌的细胞因子基因治疗在实验室研究和动物实验中观察到了明显的疗效, 但在临床应用的有效性、安全性上还需要深入的研究, 在基因导入的载体和靶向性上也需要进一步的完善[57-60]. 如何使联合基因治疗作到更加稳定、高效、安全, 以便进一步应用于临床治疗, 还有待于进一步的研究和探讨. 此外, 如何解决所导入的细胞因子基因对机体的潜在的毒副作用和损伤, 避免外源基因对正常细胞的致突变作用及引起自身免疫反应, 也有待于进一步深入细致地总结和摸索. 总之, 动物实验及实验室研究证实了细胞因子基因疗法对大肠癌的治疗价值, 但是实验研究要过度到临床应用尚有不少问题和困难, 相信随着对细胞因子及其基因的研究的不断深入, 随着关键技术的逐步解决, 大肠癌的基因治疗将不断完善, 并早日为临床广大患者服务.
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