传染性非典型肺炎患者不同病程粪便标本中SARS-CoV的分离与鉴定

摘要

目的: 从粪便标本中分离并鉴定SARS-CoV.

方法: 粪便浸出液接种Vero-E6细胞, 盲传至出现明显的细胞病变效应(CPE), 并能稳定传代. 采用电镜法和RT-PCR技术鉴定细胞培养物中的SARS-CoV (本实验均在BSL-3实验室完成).

结果: 大部分样本用Vero-E6细胞盲传3代后发现明显的CPE, 并能稳定传代. 电镜负染检查, 出现CPE的细胞可查见病毒颗粒; 培养物上清RT-PCR扩增均为阳性. 粪便样本直接用RT-PCR检测, 阳性率仅为50%, 细胞培养的检出率为73%.

结论: 采用细胞培养结合RT-PCR技术检测粪便标本SARS-CoV比粪便标本直接RT-PCR的阳性率高.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: December 12, 2003
Revised: January 9, 2004
Accepted: January 13, 2004
Published online: May 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

SARS冠状病毒(SARS-CoV)是一种新的冠状病毒[1-6], 经呼吸道传播, 传染性强, 潜伏期短, 死亡率高, 主要分布在人体的肺、肝等器官及全身的淋巴组织, 同时也可存在于血液和粪便[3,7].

迄今为止, 关于SARS-CoV的分离培养, 主要见于对鼻咽拭子等呼吸道样本以及尸解组织器官的病毒培养, 尚未见对患者粪便标本进行SARS-COV分离培养的报道. 我们采用体外病毒分离技术从北京佑安医院2003-05-16/06-09收集的12例患者30份标本中, 分离获得了SARS-CoV原始分离物.电镜和RT-PCR技术均证实细胞培养物中含有SARS-CoV. 现报道如下:

1 材料和方法

1.1 材料

病例与样品: 粪便标本由北京佑安医院提供, 时间2003-05-16/06-09, 所有患者都符合WHO对SARS疑似病例的诊断定义 (http://www.who.int/csr/sars/guidelines/en). 12例SARS患者中男5例, 女7例, 27-63岁, 病程 12-65 d (从发病之日计算), 共30份粪便样本(部分样本来自同一患者的不同病程). 引物: 根据SARS-CoV BJ01株基因组序列(AY278488),设计4对引物(其中2对为巢式引物), 序列如下: SARS73: 5'CAAAACCCCAACTTTGAAAT 3'和 5'CAGAGGTGGCAACACTGTAA 3', 扩增产物长度为226 bp, SARS73巢式引物(SARS73N): 5'CTTTTATTGAGGACTTGCTCT 3'和5'ACTTCTGCGCACAAATGAG 3', 扩增产物长度118 bp; SARS81: 5'AACTCCTGGAACAATGGAAC 3'和 5'TAAGCCACATCAAGCCTACA 3', 扩增产物长度为238 bp, SARS81巢式引物(SARS81N): 5'TTCCTAGCCTGGATTATGTT 3'和 5'AGCACAAAACAAGCAAGTGT 3'扩增产物长度120 bp. 上述引物分别位于SARS冠状病毒S糖蛋白和M蛋白基因的保守区.

1.2 方法

1.2.1 粪便样本处理: 挑取少许样本至一1.5 mL离心管中, 加入1 mL生理盐水, 振荡混匀, 室温5 000 rpm离心3 min. 取上清液140 mL用来提取病毒RNA, 其余上清通过0.22 mm滤膜过滤, 获得粪便浸出液, 用于病毒分离.

1.2.2 SARS-COV分离: Vero-E6 细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养传代, 细胞接合度达到80-90%时, 接种粪便浸出液1 mL, 感染2 h. 随后吸出粪便浸出液, 加1 mL上述DMEM, 置CO₂培养箱37 ℃培养. 2 d后每天在显微镜下观察细胞状态, 记录是否出现细胞病变效应(CPE). 如果不出现CPE, 4-6 d盲传1次. 传代至出现90 % CPE时, 收集病毒液, 转到25 cm²细胞培养瓶中放大增生. 富集足够的病毒, 保存毒种, 进行电镜鉴定.

1.2.3 电镜和RNA样本制备: 用QiAamp Viral RNA 提取试剂盒(GIAGEN产品)分别从粪便浸出液和出现CPE的细胞培养上清液中提取RNA, 用于逆转录PCR. 出现CPE的培养细胞用20-30 mL/L戊二醛固定液固定2 h, 用于电镜检查.

以上操作均在中国科学院北京基因组学研究所/北京华大基因研究中心的BSL-3实验室内进行.

1.2.4 电镜鉴定: 以30 g/L 磷钨酸溶液负染色, 透射电镜观察.

1.2.5 RT-PCR检测: 病毒RNA逆转录用Promega的Reverse Transcription System, 按说明书操作. PCR及巢式PCR按常规方法进行[2,8].

1.2.6 血清抗体的测定: 采用ELISA方法, 用酶标仪(Multiskan Ascent, Finland)测定AD₄₅₀(参考波长为630 nm), IgG大于0.18, IgM大于0.16判为阳性.

2 结果

2.1 病毒分离和电镜鉴定

从12例患者共30份标本中成功分离得到19 株原始分离物, 多数标本用Vero-E6细胞盲传3代后即出现明显的CPE(图1), 并能稳定传代. 电镜负染检查从粪便浸出液接种的病变Vero-E6细胞, 均查见病毒颗粒(图2).

图1 粪便样本传第3代Vero-E6细胞.

图2 粪便标本接种Vero-E6细胞培养液中的病毒颗粒.

2.2 RT-PCR扩增结果

临床粪便样本30份直接用RT-PCR法扩增, 其中阳性15份, 阳性率为50%(15/30);细胞培养病毒阳性19份, 经RT-PCR检测全为阳性, 阳性率为73%(19/26)(表1). 对其中12例的粪便标本和细胞培养分离物同时进行RT-PCR和巢式PCR(SARS73和SARS81引物及其相应的巢式引物), PCR反应产物的大小与预期结果完全相同.

表1 12例SARS患者粪便标本SARS-COV的不同方法鉴定结果.

病例	年龄/性别	取样时间	病程(d)	临床样本RT-PCR结果	分离结果	分离后RT-PCR结果	IgG		IgM
							5.24	6.3	5.24	6.3
		03-5-16	24	+	+	+
	63/女	03-5-20	28	+	+	+
1		03-5-23	31	+	+	+	0.489	ND	0.073	ND
		03-5-27	35	-	+	+
		03-6-03	42	-	+	+
2	48/女	03-5-16	27	+	+	+	0.242	ND	0.076	ND
		03-5-16	32	+	+	+	ND	ND	ND	ND
3		03-5-20		+	+	+
	56/女	03-5-16	36	+	+	+	ND	ND	ND	ND
		03-5-20	58	-	+	+
4	60/男	03-5-23	62	+	NS	NS	ND	ND	ND	ND
		03-6-06	65	+	+	+
5	35/女	03-5-16	53	+	+	+	0.352	0.462	0.112	0.150
6	41/女	03-5-16	33	+	+	+	ND	ND	ND	ND
		03-5-20	30	-	+	+
		03-5-27	34	-	+	+
	50/女	03-6-3	41	-	-	-
7			48	+	+	+	0.711	1.026	0.054	0.041
		03-6-6	51	-	NS	NS
		03-6-9	54	-	+	+
	27/男	03-5-27	12	-	+	+
8		03-5-30	15	-	+	+	ND	0.127	ND	0.031
		03-6-6	22	-	-	-
		03-6-09	25	+	+	+
		03-5-16	16	+	+	+
9	48/男	03-5-23	23	-	NS	NS	0.061	0.148	0.057	0.072
10	48/女	03-5-30	62	+	-	-	0.529	ND	0.041	ND
11	48/男	03-5-27	19	-	-	-	0.051	0.115	0.010	0.016
		03-5-30	19	-	NS	NS
12	30/男	03-6-6	26	-	-	-	ND	0.118	ND	0.021
		03-6-9	29	+	-	-

3 讨论

在SARS患者体内的肺组织、肾脏、粪便中已发现冠状病毒[7,9], 可是从粪便中分离冠状病毒较为困难[10], 至今为止没有报道从粪便分离病毒的例子. 我们对佑安医院2003-05住院的12例临床诊断SARS患者的粪便标本进行SARS-CoV检测, 从多数标本(19/26)中成功地分离出SARS-CoV(其中包含病程长达65 d的SARS患者粪便标本), 并通过电镜形态学、血清学及RT-PCR扩增, 对分离的病原体予以鉴定. 所以SARS-CoV能否通过消化道传播, 值得进一步研究.

RT-PCR是目前用来检测SARS病原体的重要方法之一, 在我们检测的30份标本中, 粪便标本直接RT-PCR的阳性率只有50%(15/30), 经过病毒培养后阳性率为73%(19/26), 表明病毒培养可提高粪便标本SARS-COV的检出率.由于标本来自多个患者的不同病程, 病毒载量不同, 出现CPE的时间也不同. 1号患者2003-05-20的样本, 在传第二代48 h即出现CPE, 第三代后即可以接种到单层Vero细胞的培养瓶中稳定传代. 大多数样本由于病毒载量较低, 在盲传三代后方可观察到CPE . 另外传代过程中收集的病毒培养液和细胞, 须在-20 ℃反复冻融, 并吸附染毒2 h, 这是成功分离病毒的关键.

备注

$[Footnotes]

参考文献

1.	祝 庆余, 秦 鄂德, 王 翠娥, 于 曼, 司 炳银, 范 宝昌, 常 国辉, 彭 文明, 杨 保安, 姜 涛. 非典型肺 炎病例标本中新型冠状病毒的分离与鉴定. 中国生物工程杂志. 2003;23:106-112.  [PubMed]  [DOI]

2.	Ruan YJ, Wei CL, Ee AL, Vega VB, Thoreau H, Su ST, Chia JM, Ng P, Chiu KP, Lim L. Comparative full-length genome sequence analysis of 14 SARS coronavirus isolates and common mutations associated with putative origins of infection. Lancet. 2003;361:1779-1785.  [PubMed]  [DOI]

3.	Peiris JS, Lai ST, Poon LL, Guan Y, Yam LY, Lim W, Nicholls J, Yee WK, Yan WW, Cheung MT. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361:1319-1325.  [PubMed]  [DOI]

4.	Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt HR, Becker S, Rabenau H, Panning M, Kolesnikova L, Fouchier RA. Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348:1967-1976.  [PubMed]  [DOI]

5.	Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, Tong S, Urbani C, Comer JA, Lim W. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348:1953-1966.  [PubMed]  [DOI]

6.	聂 青和, 罗 新栋, 惠 武利. 一种新型传染病: 严重急性呼吸综合征. 世界华人消化杂志. 2003;11:881-887.  [PubMed]  [DOI]

7.	Holmes KV. SARS coronavirus: a new challenge for prevention and therapy. J Clin Invest. 2003;111:1605-1609.  [PubMed]  [DOI]

8.	Wang Y, Ma WL, Song YB, Xiao WW, Zhang B, Huang H, Wang HM, Ma XD, Zheng WL. Gene sequence analysis of SARS-associated coronavirus by nested RT-PCR. Diyi Junyi Daxue Xuebao. 2003;23:421-423.  [PubMed]  [DOI]

9.	田 耕, 张 泰昌, 杨 惠青. 老年SARS患者41例消化系统损害的临床分析. 世界华人消化杂志. 2004;12:233-235.  [PubMed]  [DOI]

10.	陆 海英, 霍 娜, 童 一帆, 王 广发, 李 海潮, 聂 立功, 阙 呈立, 李 楠, 马 静, 徐 小元. SARS伴腹泻病例的临床特点. 世界华人消化杂志. 2003;11:1929-1931.  [PubMed]  [DOI]