细胞凋亡蛋白在肝癌发生过程中的作用

摘要

目的: 进一步探讨促凋亡蛋白Bid在肝癌发生、发展过程中的作用.

方法: 应用基因毒性化学剂二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)制备肝癌动物模型, 通过阻断肝细胞凋亡信号传导途径, 观察肝癌发生过程中肝细胞的增生指数(BrdU LI)与凋亡比率(AI)及与肿瘤发生的关系.

结果: (1)在DEN用药后的第3 d和第10 d, 野生型小鼠肝细胞BrdU标记指数和凋亡细胞百分比分别明显高于Bid缺陷小鼠(P<0.05). (2)在DEN用药后的第4 mo, 野生型小鼠肝内损伤性结节的数量和表面积明显多于Bid缺陷小鼠, 二者间具有统计学意义(P<0.001).

结论: Bid缺陷小鼠对DEN诱导的肝癌具有明显的抵抗作用, 这一作用可能与早期肝细胞凋亡有关.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: November 18, 2003
Revised: January 9, 2004
Accepted: February 1, 2004
Published online: May 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

细胞增生和凋亡之间的失平衡是肿瘤发生最根本的原因.细胞对任何包括化学、物理和生物的有害刺激的反应是通过自身修复、死亡、再增生等方式使机体恢复自身平衡, 细胞在损伤修复过程中的错义修复导致基因的突变使细胞获得了异常增生能力, 便发生了肿瘤.实际上, 肿瘤组织内细胞增生和凋亡比率均较正常状态的组织有明显增加, 而增生比率高于凋亡. Bid是Bcl-2家族成员中一个促凋亡蛋白, 通过死亡受体激活细胞凋亡, 尤其是肝细胞的凋亡过程.我们应用化学致癌模型和Bid缺陷小鼠研究细胞凋亡在肝癌发生的早期作用, 设想是早期凋亡刺激细胞增生, 发生基因变异的细胞较正常细胞具有明显的增生优势, 通过比较野生型和Bid缺陷鼠对DEN诱导致癌损伤的反应和观察细胞增生和凋亡的比率进一步探讨肝癌发生的机制.

1 材料和方法

1.1 材料

♂C57BL/B6小鼠, 野生型和Bid缺陷型各14只 (由美国匹斯堡大学病理系荫博士提供), 分别分为DEN组和对照组. DEN组小鼠出生后第14 d腹腔内注射DEN 15 mg/g, 对照组注射同体积的生理盐水, 饲养3、10 d和4及8 mo分别杀鼠, 在杀鼠前2 h腹腔注射30 mg/kg BrdU (Sigma, 美国), 收集肝组织标本分别放置液氮中或制备石蜡切片.

1.2 方法

1.2.1 肝细胞凋亡和增生的检测: 采用TUNEL试剂盒(Roche, 美国)检测肝细胞的凋亡, 操作按照说明. 细胞增生的检测应用抗BrdU单克隆抗体(Dako公司, 美国)进行免疫组化染色.

1.2.2 特殊酶学染色: 葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)染色: 冰冻肝组织切片戊二醛固定后用2 g/L硝酸银和0.53 g/L G-6-Pase共同孵育45 min, 然后用75 g/L硫酸铵孵育2 min, 水洗后用戊二醛和冰醋酸按一定比例混合固定, HE染色封片. GST-pi染色: 采用兔抗鼠GST-pi多克隆抗体(StressGen, 美国)进行免疫组化染色.

1.2.3 肝细胞损伤结节或肝肿瘤: HE染色的肝组织切片在显微镜下观察和计数肝损伤或肝肿瘤结节的数量, 应用SPOT软件计量结节的面积, 求结节面积与全肝面积的比值.

统计学处理 细胞增生及凋亡指数和肝损伤结节的数量及平均面积采用Student t检验, P值小于0.05为有显著差异.

2 结果

2.1 肝损伤结节的形态学及酶学特点

在DEN暴露第4 mo时显微镜下有4种不同改变: (1)嗜碱性结节, 细胞体积小于正常, 核大, 核/浆比率增加, 糖原减少, 核糖体丰富. (2)空泡细胞, 细胞肿胀, 空泡变性, 体积稍大, 有脂肪积累和糖原丢失. (3)嗜酸细胞, 细胞内富含糖原, 浆内大量的嗜伊红染色. (4)储脂细胞, 胞质内较多脂滴. 此外, 可在癌变前结节发现较多卵圆细胞.除嗜伊红结节外, 绝大部分结节呈GST-pi染色阴性, 所有结节G-6-Pase染色呈阴性. 在DEN处理8 mo后, 大部分结节周边有明显边界, 结节明显增大, 形成腺瘤样结构, 部分结节内肝细胞核深染, 可见有丝分裂征象, 细胞排列为多层结构, 具备了肝癌的形态学特征.在对照动物未发现肝损伤结节或肿瘤.

2.2 肝损伤结节面积及数量的测定

肝内结节的面积单位为χ², 全肝面积单位为mm², 分别将结节的数量及所占全肝面积比率在相同处理时间不同基因表型间进行统计学比较(表1). 在DEN处理4 mo后, 肝内结节数量及面积在野生鼠明显多于Bid缺陷鼠(P<0.05), 但8 mo后, 肝结节在基因表型间的差异消失.

表1 DEN体内诱导肝损伤结节的效果.

基因表型	n	DEN暴露时间	平均结节面积/全肝面积(m2/mm2)	平均结节数
野生型	10	4 mo	572 570.4±63 242.6a	3.6±2.065b
Bid缺陷型	12	4 mo	79 723.6±10 771.1	1.0±0.577
野生型	11	8 mo	6.29e+07±1.33e+0	10.27±7.52
Bid缺陷型	13	8 mo	2.14e+07± 2.14e+07	9.02±4.23

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs Bid缺陷型动物.

2.3 肝细胞增生及凋亡测定

DEN处理后第3、10 d和第4、8 mo, 肝组织标本分别进行BrdU和TUNEL染色, 显微镜下计数每1 000个细胞中的阳性细胞数, 得出细胞增生标记指数(BrdU LI)和凋亡比率(AI). 结果显示, DEN暴露后3 d, 野生鼠细胞凋亡数明显高于Bid基因缺陷鼠; 但BrdU标记指数在两组间无显著差异, 均接近于对照组; 10 d后细胞凋亡在野生鼠仍明显高于Bid基因缺陷鼠, 但与第3 d水平比较无明显改变, 而在Bid基因缺陷鼠则有显著下降, 接近对照组; 此时BrdU标记指数在野生鼠显著升高, 而Bid基因缺陷鼠仍接近对照组, 组间差异明显. 提示DEN暴露后, 肝脏对损伤的反应是发生细胞凋亡, 肝细胞数量的减少继发细胞大量增生.在DEN处理后4和8 mo再次检测BrdU标记指数发现, 野生鼠肝结节外BrdU标记指数仍显著高于Bid缺陷型, 而在8 mo肝结节内比较, 两组则无明显差异(表2).

表2 DEN肝细胞增生及凋亡指数的测定(mean±SD).

表型	n	DEN暴露时间	AI	LI
Bid缺陷型	3	3 d	11.04±2.97	33.5±8.89
野生型	3	3 d	19.83±3.21a	34±6.66
Bid缺陷型	3	10 d	7.71±3.21	24.5±5.47
野生型	3	10 d	16.21±3.24a	54.06±11.99a
Bid缺陷型	11	4 mo	n.d.	1.42±0.55
野生型	7	4 mo	n.d.	3.07±1.77a
Bid缺陷型	8	8 mo	n.d.	1.05±0.50(OF)
野生型	8	8 mo	n.d.	1.97±0.47(OF)a
Bid缺陷型	8	8 mo	n.d.	10.12±5.60(IF)
野生型	8	8 mo	n.d.	11.61±4.77(IF)

^aP<0.01 vs Bid缺陷型动物; n.d., 未测定; OF, 肝外结节; IF, 肝内结节.

3 讨论

普遍认为: 肿瘤的发生是异常细胞失去了对凋亡信号的反应, 使这部分细胞获得不死性或生存期明显延长, 细胞增生比例大于细胞死亡, 二者之间失去平衡. Schulit-Hermann et al少数人[1-3]近年提出了一些不同的观点, 癌前病变的细胞对细胞凋亡信号刺激是有反应的, 细胞增生和凋亡相互间有联系, 二者在肝肿瘤发生过程中均有增高, 二者间的比率调节着细胞向恶性变发展.Grasl-Kraupp et al[3]报道肿瘤细胞较周围正常细胞的增生和凋亡率分别高出24倍和7.5倍, 在肿瘤发生过程中伴有选择性细胞增生和死亡. 本文结果显示, 在DEN暴露的较早期, 野生小鼠肝细胞凋亡指数和增生率均高出Bid缺陷小鼠2倍; 在DEN暴露后4 mo, 野生小鼠肝内癌前损伤结节的平均数量和面积也较Bid缺陷小鼠明显增多, 从DEN暴露后4和8 mo的标本中可以观察到癌前结节向癌变进展的质变过程. 对于DEN暴露8 mo后, 野生和Bid缺陷型小鼠在肝内癌前结节和肿瘤数量及面积之间差异不再有明显区别的解释, 目前尚无一个客观明确的认识.根据肝细胞凋亡特点分析, 在DEN刺激下, 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体首先被激活, 导致Caspase 8的活化, 后者水解Bid使之活化后诱导一系列参与凋亡的酶学反应, 最后发生肝细胞凋亡. 细胞的凋亡诱导了细胞增生, 而发生DNA损伤的肝细胞较正常肝细胞具有更大的增生潜力, 形成有遗传物质改变的、生长力旺盛的细胞克隆, 也就是癌前结节. 这一解释受到Knight et al[4]研究结果的支持, 他们发现在TNF受体1缺乏的鼠暴露于肝脏的致癌剂后, 肝脏卵圆细胞, 有人认为是具有增生潜力或癌变前的细胞受到损伤, 其致瘤性明显减弱. 因此他们认为TNF受体途径参与肝癌发生过程中癌前卵圆细胞的增生.TNF受体的作用是通过诱导凋亡还是其他机制有待于进一步证实. 然而, 在肝癌发生过程中由于细胞凋亡和增生均有增加, 因此他们之间s的关系是十分复杂的, 在癌发生的不同阶段他们之间的关系也可能会发生不同的改变. 我们的结果提示细胞凋亡对增生的刺激也许仅发生在肝癌发生的早期, 在肿瘤发展过程中其他因素参与, 或同一种蛋白还有其他功能, 如Bid是否还参与细胞周期的调节等, 有可能使其在肿瘤发生过程中的作用发生改变, 需进一步进行研究.

备注

$[Footnotes]

参考文献

1.	Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky B, Müllauer L, Taper H, Huber W, Bursch W, Schulte-Hermann R. Inherent increase of apoptosis in liver tumors: implications for carcinogenesis and tumor regression. Hepatology. 1997;25:906-912.  [PubMed]  [DOI]

2.	Fausto N. Mouse liver tumorigenesis: models, mechanisms, and relevance to human disease. Semin Liver Dis. 1999;19:243-252.  [PubMed]  [DOI]

3.

Grasl-Kraupp B, Rossmanith W, Ruttkay-Nedecky B, Müllauer L, Kammerer B, Bursch W, Schulte-Hermann R. Levels of transforming growth factor beta and transforming growth factor beta receptors in rat liver during growth, regression by apoptosis and neoplasia. Hepatology. 1998;28:717-726.  [PubMed]  [DOI]

4.	Knight B, Yeoh GC, Husk KL, Ly T, Abraham LJ, Yu C, Rhim JA, Fausto N. Impaired preneoplastic changes and liver tumor formation in tumor necrosis factor receptor type 1 knockout mice. J Exp Med. 2000;192:1809-1818.  [PubMed]  [DOI]