肿瘤标志物的蛋白质组学

摘要

随着蛋白质组学概念的提出及其技术的不断发展, 人们可以从细胞蛋白整体水平研究肿瘤的发病机制, 寻找肿瘤诊断和预后的特异性标志. 蛋白质组学表达模式研究的技术包括用于蛋白质分离的双向凝胶电泳, 用于鉴定的质谱分析及用于蛋白质对比研究的数据库, 这些技术正应用于肿瘤标志物的寻找和鉴定. 人们已在肾细胞癌中找到相关的诊断标志, 并建立了膀胱癌相关蛋白数据库; 在肝癌研究中也发现了大量可能用于早期诊断和肿瘤分型的蛋白; 在肺癌早期可检测"恶性"蛋白信号, 预测肿瘤发生和观察化疗效果; 在卵巢肿瘤中联合应用筛选的肿瘤标志和CA125可明显提高肿瘤的检出率; 另外蛋白质组学方法在乳腺癌、结肠癌、白血病等疾病研究中的应用也日益广泛. 尽管这项技术仍有不足, 但他在不断完善, 使我们能发现更多敏感、特异的肿瘤标志物.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: October 27, 2003
Revised: December 9, 2003
Accepted: January 8, 2004
Published online: May 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

恶性肿瘤是一种多基因参与的复杂疾病. 其基因表达分析涉及转录组及蛋白质组学方法. 随着1994年Winkins提出蛋白质组学的概念和近期人类基因组计划的完成, 生命科学已进入后基因时代, 人们从组织和细胞蛋白整体水平研究肿瘤成为可能. 因此用蛋白质组学方法从整体上研究肿瘤地发病机制, 寻找肿瘤诊断和预后的特异性标记以及药物治疗的靶标已成为近期研究的热点[1-3].

1 蛋白质组学研究的技术

蛋白质组学研究涉及蛋白质表达模式研究和功能模式研究, 目前以前者研究较为集中. 蛋白质表达模式研究的支撑技术主要有蛋白质的分离、鉴定技术和生物信息学. 其中蛋白质的分离技术有O'Farrell 于1975年创立的双向凝胶电泳(2DE), 目前已发展到固相pH梯度(IPG) 凝胶电泳、双向高效柱层析技术以及毛细管电泳法. 2DE技术仍在不断地完善和改进中, 如Pharmacia公司的2DE-MS自动化系统及第二相电泳中, 6-12块胶同时电泳的Ettan系统.

蛋白质的鉴定技术主要为质谱法(MS), 即利用样品离子化后, 离子间的质荷比(m/z)的差异来分析确定样品的分子质量. 现最常用的有两种, 即电喷雾质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS).

近来出现所谓第二代蛋白质组学研究方法为蛋白质精确定量开辟了新的途径. 这些方法包括荧光差异显示双向电泳(flourescence 2D differential gel-electrophoresis, F-2D DIGE)、Gygi建立的同位素亲和标签(isotope-coded-affinity tag, ICAT)和蛋白芯片等. 为克服2D-MS系统的局限性, 还出现液质联用技术: 液相色谱- 电喷雾质谱联用(LC-MS-MS)、电喷雾串联质谱(ESI-MS-MS)、多维色谱技术和多维蛋白质鉴定技术.

生物信息学应用于构建和分析2D电泳图谱及数据库的搜索和构建. 目前应用最为普遍的是SWISS-PROT和GENPETP等组成的NRDB数据库及由美国国家生物技术信息中心/欧洲生物信息学研究所(NCBI/EBI)共同编辑的dbEST数据库.

2 蛋白质组学技术在肿瘤标志物研究中的应用

2003-03在美国圣巴巴拉召开的"肿瘤标志物: 从发现到应用"会议上,大会主席Herbert A回顾总结了近年来生物技术发展对新的肿瘤标志物发现的作用时, 认为2D电泳结合MS、高压液相分析(HPLC)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS), LC-MS-MS等技术使人们可以从蛋白质水平分析潜在的肿瘤标志物, 从而使新标志物的发现提升到一个更高的水平[4].

应用差异蛋白质组学技术可以比较肿瘤和正常细胞之间的蛋白质组异同, 从而发现肿瘤特异性蛋白, 找到肿瘤标志物, 这是近期研究中的热点.

Sarto et al[5]将10个肾细胞癌组织和10个正常肾组织的蛋白质双向电泳图谱进行对比分析, 发现有4种蛋白质在肾癌中缺失, 而谷胱苷肽过氧化物酶两种异构体、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)单体只出现在正常组织中, Mn-SOD多聚体只出现在肿瘤组织中, 通过生物信息学进一步分析发现, 该蛋白质表达变化与染色体变化存在着相关性, 认为这种蛋白可以作为肾细胞癌的诊断标志物.

Celis et al[6]采用2D电泳、微量蛋白质测序、MS、冰冻切片免疫荧光检测等方法对膀胱癌组织和原代培养的膀胱癌细胞进行研究, 从中发现20多个膀胱癌相关蛋白, 建立了膀胱癌蛋白质的数据库, 该库可以提供2D电泳凝胶图象、蛋白质的生物特性及与疾病进程的关系. 他们对膀胱鳞状细胞癌患者进行随访, 通过尿液中蛋白质组学变化判断有否肿瘤转移, 并发现特异性肿瘤标志物.

肝细胞肝癌(HCC)的肿瘤标志物研究较多, 除了临床最常用的甲胎蛋白(AFP)外[7], 还包括癌胚抗原(CEA)、铁蛋白、a-L-岩藻糖苷酶、g-GT、组织多肽受体、肝细胞生长因子(HGF)等[8]. 目前肝癌标志物的蛋白质组学研究进展较快. Yu et al[9]对照正常肝细胞系L- 02和肝癌细胞BEL7404, 发现了99种蛋白质点在表达的质和量上有显著差异; Seow et al[10]用蛋白质组学方法研究肝癌细胞株HCC- M蛋白, 分析了408个点, 除发现部分看家蛋白外, 还分析与癌变相关蛋白, 如14- 3- 3蛋白、连接素(annexin)、抑制素(prohibitin)等; Ou et al[11]对其中301个点进行MALDI-TOF-MS分析, 建立了HCC- M蛋白表达数据库; Poonet al[12]用全蛋白组表达谱(comprehansive proteomic profiling)方法分析肝细胞肝癌(HCC)患者及慢性肝病患者的血清, 发现在常见的2 384个血清蛋白质组特征中, 有250个在肝癌和慢性肝病间有显著差异, 在进展期的肝细胞肝癌(包括有淋巴浸润和远处转移两种亚型)患者的血清中, 这些蛋白质聚集成簇, 由此认为通过蛋白质组学技术可以找寻特异的肿瘤标志物, 用于HCC的检测和分型. Le Naour et al[13]用蛋白质组学分析了37例HCC患者和31例HBV/HCV慢性感染患者的血清, 同时还分析了116例其他肿瘤患者血清及24例正常者对照, 发现10%HCC患者的血清中可以检测到8种蛋白的自身抗体, 而健康人群中却没有. 在慢性肝炎患者血清中可检测出其中4种自身抗体, 检出率与肝癌相当, 另4种蛋白: Careticulin异构体、细胞因子8、核苷酸二磷酸激酶A、F1-ATP合成酶b亚单位的自身抗体只出现于HCC中, 与HBV/HCV状态无关, 其中Careticulin诱导的自身抗体在HCC中检出率为27%, 因此认为这些抗体的检测可以在HBV/HCV高危患者中早期诊断HCC. Steel et al[14]根据HCC高危因素将研究对象分成健康人群组、健康HBV携带者组、活动性HBV感染者组和HCC患者组, 进行血清多肽的蛋白质组学研究, 发现补体C3羧基片段和载脂蛋白A1的异构体在HCC组中显著降低, 作者认为由于患者总数较少, 尚难作出这两种蛋白与HCC疾病进展完全相关的结论, 但蛋白质组学的方法无疑可以提高用于早期诊断的肿瘤标志物的检出.

Zhukov et al[15]从肺癌筛选试验中获取的肺癌标本用激光捕获显微切割(LCM)获取纯细胞, 包括癌细胞、正常细胞及非典型腺瘤样增生(AAH)细胞, 进行SELDI-MS分析, 建立每种细胞蛋白表达谱. 与正常细胞相比, 肿瘤细胞在17-23 kD质谱范围内有3个峰值, 在AAH中为低水平, 因此用SELDI-MS方法可以从肺癌或恶变前肺泡上皮中检出"恶性"蛋白信号. 这些蛋白信号可以从肺癌高危人群中检测肿瘤的发生, 监测肺癌化疗药物的疗效.

卵巢肿瘤在临床上仍缺乏敏感特异的肿瘤标志物, 因此蛋白质组学, 特别是高通量技术和生物信息技术在这方面应用较多, 以期发现有临床应用价值的肿瘤标志物. 有研究表明, 卵巢恶性肿瘤中调节细胞周期的PCNA、癌蛋白 (Oncoprotein) 18等表达增高. Rai et al[16] 1998/2001收集了卵巢肿瘤患者术前的血清样本, 进行蛋白质组学研究, 在差异蛋白中筛选出7个标志蛋白, 并对其中3个进行纯化. 发现单独应用其中任一标志对卵巢肿瘤敏感性都不及CA-125, 而联用4个标志, 则明显优于CA-125.如将特异性固定在94%时, 两个标志联合CA-125可使敏感性高达94%(单用CA-125时, 敏感性为81%), 因此认为用蛋白质组学方法可以筛选到敏感特异的肿瘤标志, 与现有的肿瘤标志物相结合可明显提高肿瘤的检出率. Petricoin et al[17]用生物信息学技术, 通过对50例卵巢癌患者和50例非卵巢肿瘤人群的血清蛋白质谱特征建立运算模型, 并将该模型以盲法检测临床116份血清标本, 发现其敏感性为100%, 特异性为95%, 阳性预检准确率达94%.

在乳腺癌肿瘤中, 核增生抗原和膜蛋白HS90、pHS60在侵袭性癌中高表达[10]; 应用SELDI-TOF-MS方法可以对乳腺癌细针穿刺的样品进行蛋白质组学分析, 完成临床肿瘤标志物的检测.

另外蛋白质组学技术在结肠癌、白血病、淋巴瘤的肿瘤标志物研究中的应用也有不少报道.

3 前景与展望

总之, 蛋白质组学本身正在迅速发展, 同时随着其在肿瘤标志物研究中的广泛应用, 新的肿瘤标志物不断被发现, 这些标志物临床应用的重要性日渐凸现. 由于肿瘤标志物的多样性及复杂性, 须有国际间研究组织的合作, 以期建立网络数据库. 美国国家癌症研究所(The National Cancer Institute)建立了早期检测研究网(Early Detection Research Network, EDRN), 目的在于加速新发现的肿瘤标志物临床应用, 同时评估其危险因素. 该网络建立了生物标志物发展评价的五阶段标准: (1)临床前探索期, 确定可靠方向. (2)临床分析和验证期, 分析评价标志物对疾病的检测能力. (3)回顾性纵向分析设定的指标, 对临床前疾病的检测能力, 制定阳性筛选标准. (4)前瞻性观察标志物对疾病的检出率及假阳性率. (5)设计前瞻性临床随机试验, 对普遍人群进行筛查[18].

Wei [4]认为建立肿瘤的生物储备和组织库(biorepository and tissue bank)是非常必要的, 他可以成为发现新标志物的平台.目前一项大规模的建库工作正在进行, 计划收集50 000病例的完整的人口统计资料、临床数据和3年随访分析结果.

尽管蛋白质组学技术仍有许多不足, 但其本身的发展非常迅速, 特别是高通量、自动化对大量基因及表达产物的大规模分析技术, 使我们能够发现更有高度敏感性和特异性的肿瘤标志物用于临床.

备注

$[Footnotes]

参考文献

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