基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-05-15; 12(5): 1119-1124
在线出版日期: 2004-05-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i5.1119
理肠中药方对溃疡性结肠炎大鼠结肠细胞凋亡及其调控基因表达的影响
范恒, 邱明义, 梅家俊, 沈关心, 刘松林
范恒, 华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科 湖北省武汉市 430022
邱明义, 梅家俊, 刘松林, 湖北中医学院 湖北省武汉市 430061
沈关心, 华中科技大学同济医学院 湖北省武汉市 430022
范恒, 男, 1966-04-29生, 湖北浠水人, 汉族, 1990年湖北中医学院本科毕业, 1997年湖北中医学院硕士研究生毕业, 2003年湖北中医学院博士研究生毕业, 副主任医师、副教授, 主要从事胃肠病的临床与基础研究.
基金项目: 湖北省教委资助项目, No. 99Z014.
通讯作者: 邱明义, 430061, 湖北省武汉市, 湖北中医学院. fanheng001@hotmail.com
电话: 027-68889082
收稿日期: 2003-10-15
修回日期: 2003-11-09
接受日期: 2003-12-08
在线出版日期: 2004-05-15

目的: 观察理肠中药方对溃疡性结肠炎大鼠结肠细胞凋亡及其调控基因Bcl-2, Bax, Fas蛋白表达的影响, 分析其作用机制.

方法: 应用2, 4-二硝基氯苯(DNCB)免疫加醋酸局部灌肠法建立UC大鼠模型, 将98只健康SD大鼠 (雌雄各半), 按雌雄随机分7组, 分别为乌梅丸组、白头翁汤组、参苓白术散组、痛泻要方组、SASP组、模型组和正常组, 分别观察治疗后大鼠结肠黏膜的结肠细胞凋亡及其调控基因Bcl-2, Bax, Fas蛋白表达的变化.

结果: 模型组与正常组比较AI升高(P<0.01, t = 3.835), 治疗后AI下降, 各组与模型组比较有显著性差异(P<0.05 , q = 4.210 vs 痛泻要方组或P<0.01, q = 5.973 vs乌梅丸组, q = 5.986 vs 白头翁汤组, q = 5.905 vs 参苓白术散组, q = 5.889 vs SASP组).与正常组比较均无显著性差异(P>0.05, q = 3.972 vs 乌梅丸组, q = 3.523 vs 白头翁汤组, q = 3.694 vs 参苓白术散组, q = 3.549 vs 痛泻要方组, q = 3.727 vs SASP组), 理肠中药方、SASP组五组间比较, 均无显著性差异(P>0.05, F = 2.96), 正常组Bcl-2/Bax>1, 细胞较少发生凋亡, 而二者比较, 有显著意义(P<0.01, t = 3.956 vs 模型组). 理肠中药方、SASP组五组Bcl-2/Bax>1, 模型组Bcl-2, Bax, Fas与正常组比较, 有非常显著意义(P<0.01, t = 4.573, 4.826, 4.758), 且模型组Bcl-2/Bax<1细胞凋亡占优势, 各治疗组与正常组无统计学意义(P>0.05, F = 2.69), 而与模型组比较有显著意义(P<0.05, q = 4.98 vs 乌梅丸组, q = 4.77白头翁汤组, q = 4.68 vs 参苓白术散组, q = 4.56 vs 痛泻要方组, q = 4.64 vs SASP组), 各中药组Bcl-2, Bax, Fas蛋白阳性率均与SASP组疗效相当(P>0.05, F = 3.19, 3.05, 2.97), 理肠四方各组比较, Bcl-2, Bax, Fas蛋白阳性率亦无明显差异(P>0.05).

结论: 细胞凋亡及其调控基因Bcl-2, Bax参与UC的形成, 中药及 SASP均有良好的治疗效果.

关键词: N/A
引文著录: 范恒, 邱明义, 梅家俊, 沈关心, 刘松林. 理肠中药方对溃疡性结肠炎大鼠结肠细胞凋亡及其调控基因表达的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(5): 1119-1124
Effect of Lichangsifang on cellular apoptosis and expression of the related regulatory genes in rats with ulcerative colitis
Heng Fan, Ming-Yi Qiu, Jia-Jun Mei, Guan-Xin Shen, Song-Lin Liu
Heng Fan, Department of Integrated Traditional and Western Medicine, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Ming-Yi Qiu, Jia-Jun Mei, Song-Lin Liu, Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China
Guan-Xin Shen, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Supported by: the education department Foundation of Hubei, No. 99Z014.
Correspondence to: Ming-Yi Qiu, Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China. fanheng001@hotmail.com
Received: October 15, 2003
Revised: November 9, 2003
Accepted: December 8, 2003
Published online: May 15, 2004

AIM: To study the immunoregulatory and treatment effects of Lichangsifang (LCSF) on apoptosis and protein expression of Bcl-2, Bax and Fas genes in rats with ulcerative colitis (UC), and to analyze its underlying mechanism.

METHODS: In the experiment, ninty-eight SD rats were randomly divided into seven groups: normal control group, pathologic control group, solfasalazine (SASP) group, Wumeiwan (WMW) group, Baitouwengtang (BTWT) group, Senglingbaishusan (SLSS) group, and Tongxieyaofang (TXYF) group. Every group had fourteen rats (seven male and seven female). Except the normal control group, A UC animal model was made with DNCB and acetic acid the other six groups, which were treated by distilled water, SASP, TXYF, WMW, BTWT, SLBSS and TXYF, respectively. After these treatment, the changes of apoptosis and protein expression of Bcl-2, Bax and Fas gene in UC were observed.

RESULTS: The level of apoptotic index (AI) in pathologic group was significantly higher than that in normal group (P < 0.01 t = 3.835). After these treatment, the degree of the AI decreased in each experimental group, as compared with the pathologic group (P < 0.05, q = 4.210 vs TXYF group or P < 0.01, q = 5.973 vs WMW group, q = 5.986 vs BTWT group, q = 5.905 vs SASP group, q = 5.889 vs SASP group). The apoptosis of normal control group (Bcl-2/Ba x> 1) togther with LCSF and SASP groups was less (P < 0.01 q = 3.972 vs WMW group, q = 3.523 vs BTWT group, q = 3.694 vs SLBSS group, q = 3.549 vs TXYF group, q = 3.727 vs SASP group). There was remarkable difference in the degree of Bcl-2 and Bax expression between pathologic group (Bcl-2/Bax < 1) and normal group (P < 0.01, F = 2.96). The degree of apoptosis in pathologic group was significantly higher than that in normal group (P < 0.05,t = 3.956 vs pathologic group). There was no remarkable difference between LCSF and SASP groups in the protein expression on Bcl-2, Bax and Fas genes in UC (P > 0.05, F = 3.19, 3.05, and 2.97).

CONCLUSION: This model induced with DNCB and acetic acid is successful. It is obvious that the apoptosis and protein expression of Bcl-2, Bax and Fas genes play an important role in the pathogenesis of UC. All the treatment groups (including SASP group) have rather better curative effects on UC by reducing apoptosis and adjusting cell immunity.

Key Words: N/A
0 引言

溃疡性结肠炎(UC)病因及发病机制仍未完全明了[1-6], 治疗也不够满意[7-12]. 细胞凋亡参与UC的发生, 虽然正常上皮细胞很少发生凋亡, 但UC时, 凋亡的结肠上皮细胞明显增多. 我们研究细胞凋亡在UC中的作用以及理肠四方对UC细胞凋亡及其调控基因Bcl-2, Bax, Fas蛋白表达的影响.

1 材料和方法
1.1 材料

理肠四方 (乌梅丸、白头翁汤、参苓白术散、痛泻要方)的所组成药物剂量如下: 乌梅丸: 乌梅16 g, 细辛6 g, 干姜10 g, 黄连16 g, 当归4 g, 附子6 g, 蜀椒4 g, 桂枝6 g, 生晒参6 g, 黄檗6 g; 白头翁汤:白头翁30 g, 黄柏24 g, 黄连10 g, 秦皮24 g; 参苓白术散: 莲子肉10 g, 薏苡仁10 g, 缩砂仁10 g, 桔梗10 g, 白扁豆15 g, 白茯苓20 g, 生晒参20 g, 甘草20 g, 白术20 g, 山药20 g; 痛泻要方: 炒白术30 g, 白芍20 g, 陈皮15 g, 防风20 g. 西药柳氮磺胺吡啶(SASP)批号为: 200111002, 由上海三维制药公司生产(250 mg/片). 40 g/L多聚甲醛、多聚赖氨酸(poly-lysine)、载玻片(防脱片剂处理)、细胞凋亡检测试剂盒、即用型SABC免疫组化染色试剂盒(Fas、Bax、Bcl-2)等均购于武汉博士德生物工程有限公司. 健康SD 健康大鼠98只(雌雄各半, 体质量300±50 g).

1.2 方法

按雌雄随机分7组, 各组均为14只(雌雄各半), 第1、2、3、4、5、6为造模组, 第7组为正常组, 而第1、2、3、4、5、6组分别为乌梅丸组、白头翁汤组、参苓白术散组、痛泻要方组、SASP组和模型组, 各组体重统计学比较无显著性差异(P>0.05). 应用2, 4-二硝基氯苯(DNCB)免疫加醋酸局部灌肠法建立UC大鼠模型[13-15]. 将大鼠颈背部用100 g/L Na2S脱毛后, 以20 g/L DNCB丙酮液0.25 mL (5滴)滴背, 1次/d, 连续14 d, 在第15 d以直径3 mm导尿管经肛门插入结肠8 cm处, 注入1 g/L DNCB乙醇0.25 mL, 在16 d同部位注入80 mL/L醋酸溶液2 mL, 准确计时10 s后, 再用生理盐水5 mL冲洗. 再饲养2 wk, 每天继续观察大鼠大便性状、饮食、毛发、活动状态等, 可以看到大鼠逐渐产生典型UC活动期症状, 30 d后造模完成后, 每组随机抽取大鼠2只, 处死后取其结肠, 病理检查确认结肠出现充血、水肿、炎细胞浸润、隐窝脓肿、杯状细胞减少、腺体破坏及小溃疡形成等一系列变化. 乌梅丸组、白头翁汤组、参苓白术散、痛泻要方组、SASP组等五组: 每组每只大鼠分别用乌梅丸液515 g/L、白头翁汤液(562 g/L)、参苓白术散液(987 g/L)、痛泻要方液(216 g/L)和SASP混悬液(26 g/L) 3 mL灌胃, 1次/d; 模型组、正常组: 每组每只大鼠均以蒸馏水3 mL灌胃, 1次/d, 以上均给药15 d.

1.2.1 细胞凋亡的检测: 结肠组织经40 g/L多聚甲醛0.1 moL/L PBS(PH7.0-7.6)固定4 h以上, 石蜡包埋, 切片(用poly-lysine载玻片)厚度6 mm; 凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活, 细胞自身的染色质或DNA被切割, 出现单链或双链切口, 并产生与DNA断点相同的3'-OH末端. 末端脱氧核糖核酸转移酶可以将地高辛的dUTP(DIG-dUTP)标记至3'-OH末端, DIG-dUTP结合在DNA断点部位, 可以通过生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DiG-Biotin)反应后, 再结合链亲和素-过氧化物酶(SABC), 然后加入显色底物DAB予以显示. 凋亡的细胞核呈黄色, 从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞.

1.2.2 Bcl-2, Bax, Fas蛋白的表达: 结肠组织经40 g/L多聚甲醛固定45-90 min, 然后0.1 moL/L PBS 4 ℃过夜, 换液1次; ABC法, 最后进行显色反应. 每组切片随机选取5张, 各随机选取5个视野, 用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统(版本9.0)测量, 确定阳性灰度级后, 测定阳性面积比.

1.2.3 细胞凋亡指数(AI)计算: 各组随机选取4个组织切片, 每一切片随机观察5个视野, 分别计数每一视野阳性细胞和阴性细胞数, 取其平均值作为该切片阳性细胞数和阴性细胞数, 以凋亡细胞数与细胞总数(阳性与阴性之和)的比率作为该切片的细胞凋亡指数(AI), 计算7组细胞凋亡指数.

统计学处理 采用SPSS10.0软件处理统计数据资料, 数据用mean±SD表示, 采用t检验和F分析(q检验).

2 结果
2.1 细胞凋亡

TUNEL阳性细胞在普通光镜下的特征是: 细胞收缩变小, 呈圆形, 与周围细胞分离, 细胞核显棕色或棕褐色或核碎裂, 为棕黄色颗粒. 光镜下, 正常组(0.010±0.002)基本未见TUNEL阳性细胞, 模型组(0.470±0.013)阳性细胞数目较多, 呈棕黄色, 而SASP 组(0.020±0.03)、乌梅丸组(0.020±0.001)、白头翁汤组(0.020±0.003)、参苓白术散组(0.020±0.002)、痛泻要方组(0.050±0.003) 仅见少量的阳性细胞散在分布, 表明UC与细胞凋亡有关, 各组治疗后凋亡细胞减少, 说明他们通过减少其细胞凋亡而达到治疗UC目的(图1A-G). 模型组与正常组比较AI升高(P<0.01), 说明细胞凋亡参与UC形成, 治疗后AI下降, 各组与模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01). 与正常组比较均无显著性差异(P>0.05), 说明SASP、理肠四方均有良好的治疗作用, 使其凋亡指数接近正常, 其治疗作用是可能通过抑制细胞凋亡达到治疗目的, 而SASP组、乌梅丸组、白头翁汤组、参苓白术散组、痛泻要方组五组间比较, 均无显著性差异(P>0.05), 其治疗影响可能相差不明显.

图1
图1 细胞凋亡图×200. A: 正常组; B: 模型组; C: SASP组; D: 乌梅丸组; E: 白头翁汤组; F: 参苓白术散组; G: 痛泻要方组.
2.2 Bcl-2, Bax, Fas蛋白表达

光镜观察正常组SASP组、乌梅丸组、白头翁汤组、参苓白术散组、痛泻要方组Bcl-2蛋白均高表达, 且大量地存在于细胞中, 细胞染色呈棕褐色, 而其Bax, Fas均低表达;模型组Bcl-2蛋白有低表达, Bax, Fas蛋白有高表达, 大量地存在于细胞中, 细胞染色呈棕黄色(图2-4A-G). 正常组Bcl-2/Bax>1, 细胞较少发生凋亡, 而二者比较, 有显著意义(P<0.01). SASP组、乌梅丸组、白头翁汤组、参苓白术散组、痛泻要方组Bcl-2/Bax>1, 说明抗细胞凋亡处于优势, UC逐渐康复. 模型组Bcl-2, Bax与正常组比较, 有非常显著意义(P<0.01), 且模型组Bcl-2/Bax<1, 细胞凋亡占优势, 说明Bcl-2, Bax参与UC的形成. 各治疗组与正常组比较无统计学意义(P>0.05), 而与模型组比较有显著意义(P<0.05), 说明各组药物包括SASP均有良好的治疗效果, 各药物治疗机制可能与减少细胞凋亡有关. 各中药组Bcl-2, Bax, Fas蛋白阳性率均与SASP组疗效相当(P>0.05, 表1), 其余中药各组(白头翁汤组、乌梅丸组、参苓白术散组、痛泻要方组)比较, Bcl-2, Bax, Fas蛋白阳性率亦无明显差异(P>0.05).

表1 UC大鼠Bcl-2, Bax, Fas蛋白表达及变化(mean±SD, n = 4).
组别Bcl-2蛋白阳性率Bax蛋白阳性率Bcl-2/BaxFas阳性率
正常组0.2 800±0.014b0.1 231±0.002b2.08±0.203b0.227±0.012b
模型组0.1 501±0.0030.3 275±0.0150.672±0.0310.303±0.011
SASP组0.2 103±0.013a0.1 735±0.030a1.519±0.127a0.263±0.018a
乌梅丸组0.2 420±0.031a0.1 725±0.025a1.577±0.105a0.246±0.031a
白头翁汤组0.2 237±0.027a0.1 821±0.021a1.533±0.103a0.265±0.021a
参苓白术散组0.2 125±0.027a0.1 803±0.021a1.580±0.112a0.272±0.009a
痛泻要方组0.2 007±0.063a0.1 428±0.035a1.274±0.157a0.284±0.021a
aP<0.05,
bP<0.01 vs 模型组.
图2
图2 Bcl-2蛋白表达图×200 A: 正常组; B模型组; C乌梅丸组; D: 白头翁汤组; E: 参苓白术散组; F: 痛泻要方组; G: SASP组.
图3
图3 Bax蛋白表达图×200. A: 正常组; B模型组; C乌梅丸组; D: 白头翁汤组; E: 参苓白术散组; F: 痛泻要方组; G: SASP组.
图4
图4 Fas蛋白表达图×200. A: 正常组; B模型组; C乌梅丸组; D: 白头翁汤组; E: 参苓白术散组; F: 痛泻要方组; G: SASP组.
3 讨论

细胞凋亡(apoptosis)是一种高度调控的细胞死亡方式, 调控凋亡过程是人类防治这些病症的新途径. 结肠细胞凋亡主要发生肠腔上皮细胞; 活动期UC除此之外, 病变处及临近的非病变处隐窝上皮细胞凋亡增加, 从而使上皮细胞构成的黏膜屏障破环, 导致结肠黏膜的损伤和溃疡[16]. UC患者肠上皮细胞的凋亡加速, 特别是活动期上皮细胞的凋亡明显增加, 参与炎症性肠病(IBD)的发生.另外, 一些细胞因子水平增高, 并与肠道炎症的发病及活动性有密切关系, 因此这些细胞因子与肠黏膜固有层淋巴细胞凋亡关系也开始受到关注, 如TNF介导细胞凋亡与抗原刺激后成熟T细胞清除有关, 而肠黏膜组织中IL-15含量增高[17], 可以介导淋巴细胞逃避凋亡. 有人研究指出患者淋巴细胞凋亡异常也是导致UC免疫功能紊乱的重要原因[18-19].

选择性地减少UC肠上皮细胞凋亡造成的组织损伤, 或选择性地诱导UC炎症细胞凋亡, 减轻炎症反应, 将可能成为治疗UC的有效方法. 由于细胞凋亡由参与凋亡调控的系列基因相对表达程度决定, 并受细胞凋亡影响[20-22], 所以我们选取Bcl-2, Bax, Fas蛋白表达作为检测指标来观察理肠四方对大鼠细胞凋亡的影响. 结果表明: 细胞凋亡参与UC的形成. 模型组Bcl-2/Bax<1, 细胞凋亡占优势, 而正常组Bcl-2/Bax>1, 细胞较少发生凋亡. Bax是编码Bcl-2相关X蛋白的基因, Bax蛋白与Bcl-2蛋白有21%的同源性, 具有对抗Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡的作用, 研究发现 Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用的强弱的关键因素[23]. 结肠上皮细胞凋亡增加, 从而使其黏膜屏障破坏, 导致UC的发生. 因此支持Itoh的观点即减少Bax表达和升高Bcl-2/Bax比率有利于抵抗慢性IBD细胞凋亡的发生[24], 而不支持Limura的观点即在UC的炎症性肠病黏膜中, Bax/Bcl-2系统似乎并不涉及诱导上皮细胞凋亡[25]. Fas在UC中的表达增加, 与正常组显著不同(P<0.01). 通过各治疗组与模型组比较, Fas有明显下降(P<0.05), 与正常组比较, 无显著差异(P<0.05), 说明理肠四方与SASP均有调节Fas的作用. 各组中药及SASP治疗后Bcl-2, Bax, Fas蛋白阳性率有不同程度变化. 说明他们均可以影响细胞凋亡达到治疗的目的. 氨基水杨酸(SASP吸收后分解物)可以减弱结肠上皮细胞凋亡[26]. 5-氨基水杨酸(5-ASA)在体外能够加速UC中性粒细胞凋亡[27]. 由此可以推测中药治疗也可影响细胞凋亡, 其具体作用机制有待进一步研究.

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