胃癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-05-15; 12(5): 1015-1020
在线出版日期: 2004-05-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i5.1015
中药消痰散结方抑制裸鼠原位移植人胃癌SGC-7901的生长转移
许玲, 魏品康, 陈亚琳, 苏晓妹, 秦志丰, 施俊, 李峻, 何金
许玲, 魏品康, 陈亚琳, 苏晓妹, 秦志丰, 施俊, 李峻, 何金, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院中医科 上海市 200003
基金项目: 军队新药基金资助项目, No. 2000b06.
通讯作者: 许玲, 200003, 上海市凤阳路415号, 中国人民解放军第二军医大学长征医院中医科. czzyk@smmu.edu.cn
电话: 021-63610109-73403
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-09
接受日期: 2003-12-29
在线出版日期: 2004-05-15

目的: 研究中药消痰散结方对裸鼠原位移植人胃癌生长转移的抑制作用.

方法: 建立裸鼠原位移植人胃癌模型; 实验分组: 对照组、中药组、化疗组、联合组各10只; 观察和比较各组肿瘤抑制率和肿瘤转移情况. 用免疫组化法定性分析和比较肿瘤转移相关指标P21 ras, P185, VEGF蛋白, KDR蛋白的表达, 用RT-PCR法定量分析和比较各组ras, cerbB2, VEGF, KDR的表达.

结果: 中药组、化疗组和联合组的抑瘤率分别为72.0%、51.3%、70.1%; 在远处淋巴结转移率和脏器转移率方面, 与对照组相比, 中药组、化疗组和联合组均减少了转移的发生, 有显著性差异(P<0.05). 中药组、化疗组、联合组在不同程度上下调了ras, cerbB2, VEGF和KDR在蛋白水平和mRNA水平的表达.

结论: 消痰散结方具有抑制裸鼠原位移植人胃癌生长和转移的作用, 其作用机制可能与下调了肿瘤转移相关基因ras, cerbB2, VEGF, KDR的表达有关.

关键词: N/A
引文著录: 许玲, 魏品康, 陈亚琳, 苏晓妹, 秦志丰, 施俊, 李峻, 何金. 中药消痰散结方抑制裸鼠原位移植人胃癌SGC-7901的生长转移. 世界华人消化杂志 2004; 12(5): 1015-1020
Xiaotansanjie recipe inhibits growth and metastasis of human gastric adenocarcinoma cell SGC-7901transplanted in nude mouse
Ling Xu, Pin-Kang Wei, Ya-Lin Chen, Xiao-Mei Su, Zhi-Feng Qin, Jun Shi, Jun Li, Jin He
Ling Xu, Pin-Kang Wei, Ya-Lin Chen, Xiao-Mei Su, Zhi-Feng Qin, Jun Shi, Jun Li, Jin He, Department of Traditional Chinese Medicine, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Supported by: New Drug R and D Fund of the PLA, No. 2000b06.
Correspondence to: Dr. Ling Xu, Department of Traditional Chinese Medicine, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, 415 Fengyang Road, Shanghai 200003, China. czzyk@smmu.edu.cn
Received: November 13, 2003
Revised: December 9, 2003
Accepted: December 29, 2003
Published online: May 15, 2004

AIM: To investigate the effects of the Xiaotansanjie recipe on the nude mouse model of human gastric carcinoma cells using orthotopic transplantation.

METHODS: Firstly we established the metastatic gastric carcinoma model of nude mice by orthotopic implantation. On the second day they were devided into four groups at random. The inhibitary rates of tumour growth were detected, and local invasiveness, the rates of metastasis in the local lymph node, lung, liver and peritoneum were compared between different groups. By Envision immunohistochemical method and semiquantitative reverse transcription polymerase chain reation, the expression of P21ras, P185, Ras, CerbB2, VEGF and KDR in gastric carcinoma were determined.

RESULTS: The inhibitary rates of Xiaotansanjie recipe group, 5-Fu group and combined group were 72.0% , 51.3% and 70.1% respectively. Compared with the control group,the rates of local invasiveness, metastasis in the lymph node and distal organs in other three groups were significantly lower (P < 0.05). The positive rate of P21ras, P185, Ras, CerbB2, VEGF and KDR in Xiaotansanjie recipe group obviously lower than those in control group (P < 0.05).

CONCLUSION: Xiao Recipe has a strong inhibitory effect on both growth and metastasis of gastric cancer, and the mechanism of that may related with the reduced expression of oncogene cerbB2, ras,VEGF and KDR.

Key Words: N/A
0 引言

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一[1-6], 早诊率低、手术切除率低、5年生存率低. 探寻有效的综合治疗措施是提高肿瘤患者生活质量、延长生存期的重要途径[7-9]. 中医认为, 肿瘤的产生主要由于脏腑、阴阳、气血失调, 在正虚的基础上, 外邪入侵, 或痰、湿、气、瘀等搏结日久, 积滞而成. 我们在临床实践中发现胃癌的形态多为肿块, 与痰结局部而形成的痰核相似, 而且胃癌浸润转移与"痰"的特性颇相似."痰"是胃癌形成和发展的重要病理物质, 消痰散结方联合化疗治疗晚期胃癌104例改善症状有效率为82.9%, 卡氏评分提高率为84.4%, 中位生存期为12.25 mo, 3年生存率为22.1%. 因此, 我们建立裸鼠人胃癌原位移植模型, 研究消痰散结方的作用如下.

1 材料和方法
1.1 材料

BALB/c无胸腺裸鼠40只, 6周龄, 雌雄各半, 质量18-20 g, 传代于裸鼠皮下的人胃癌组织SGC-7901由中国医学科学院上海实验动物中心提供, 在该中心SPF级动物实验室内饲养. 第2批实验采用上述动物48只. 消痰散结方: 天南星15 g, 半夏15 g, 茯苓15 g, 枳实10 g, 陈皮9 g, 鸡内金15 g, 炙甘草6 g全蝎6 g, 蜈蚣3条, 川贝9 g, 白芥子9 g组成, 以常规方法水煮醇澄制备成针剂, 含生药2.5 kg/L备用(由第二军医大学附属长征医院制剂中心提供). 均购自上海市药材公司, 地道药材, 产地明确, 经第二军医大学药学院生药教研室鉴定. 5-FU 250 mg/支, 氯胺酮100 mg/支, 上海旭东海普药业有限公司出品. 兔抗人cerbB2(P185)一抗, 稀释度: 1:200. 鼠抗人p21ras一抗: 稀释度: 1:60, Envision试剂(二抗), 丹麦Dako公司. 鼠抗人VEGF蛋白一抗:浓缩型抗体, 1:50稀释, 购自美国Oncogene公司. 鼠抗人KDR蛋白一抗:浓缩型抗体, 1: 50稀释, 购自福州迈新生物技术开发公司. 100 g/L多聚赖氨酸: Sigma公司提供. Trizol, 由美国Invitrogen公司提供. Amv Rtase, RNase Inhibitor和PCR试剂盒, 由TaKaRa公司提供.

1.2 方法

取传代后14 d处于对数生长期的荷瘤鼠, 从腋部皮下剥取肿瘤组织, 剪成1 mm×1 mm×1 mm小块备用. 实验动物禁食12 h, 用氯胺酮50 mg/kg ip麻醉后, 常规手术, 在胃大弯处近胃窦旁用1 mL无菌空针头划破胃壁浆肌层, 用无齿镊将破损处向内推压, 使局部胃壁形成凹龛, 植入1块瘤组织于凹内, 并在瘤块表面滴OB生物胶1滴, 40 s凝固后将胃壁回纳入腹腔, 0号丝线缝合腹膜及皮肤, 关腹. 定时观察所有模型鼠全身状况、运动情况、腹部体征. 当荷瘤鼠出现明显消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时(约12 wk), 处死动物, 观察原位肿瘤生长情况, 全面探查腹腔, 取肿大淋巴结、胸腔、腹腔内脏器以40 g/L甲醛固定, 石蜡包埋、切片, HE染色, 作组织病理学检查. 收取腹水. 取部分移植瘤组织, 放培养液中, 剪成小于1 mm×1 mm的小块, 培养液洗涤2次; 将组织小块植入培养瓶内, 置37 ℃恒温箱中, 贴壁; 加培养液平置于37 ℃的 CO2孵箱中; 培养4 d后, 在倒置显微镜下, 组织小块周围可见到新的细胞样生长物出现, 待肿瘤细胞生长旺盛, 并长满成单层时即可进行第1次传代后收获制作染色体标本. 加入秋水仙素37 ℃温育处理3 h, 加固定液后, 离心, 加低渗液处理(反复3次), 加数滴新固定液, 轻弹离心管底使细胞成混悬液后, 冰湿片滴片, 空气干燥后Giemsa染色12 min, 封片, 显微摄影.

1.2.1 动物实验: 第1次实验动物随机分为对照组、中药组、化疗组和联合组, 每组10只, 于模型建立24 h后开始给药. 对照组给予生理盐水, 每次0.2 mL, ip, 1次/d, 连续给药3 wk; 中药组给予消痰散结方, 每次0.2 mL, ip, 1次/d, 连续给药3 wk; 化疗组给予5-FU, 以生理盐水稀释成6 g/L, 每次0.2 mL, 60 mg/kg, ip, 1 wk/次, 共给药3 wk; 联合组同时给予中药组及化疗组的治疗方案. 第2次实验动物共48只, 分组同上, 每组12只, 用药方法同上.

1.2.2 P21ras, P185, VEGF和KDR蛋白染色: 操作按照Envision试剂盒说明书进行, 以PBS为一抗设阴性对照, 以丹麦Dako公司提供的阳性切片为阳性对照. 阳性部位呈棕褐色, 染色分布不均匀, 强度有差别. 以任意5个阳性区域高倍镜视野中阳性细胞所占百分比作为评定依据. 0-5%为阴性(-), 5-25%为弱阳性(+), 25-50%为中度阳性(++), 50%以上为强阳性(+++).

1.2.3 RT-PCR检测: 根据文献合成人ras, cerbB2癌基因RT-PCR引物(由上海博亚生物制品公司合成). ras基因引物序列: 正义链: 5'-ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA-3'; 反义链: 5'-TGT CTT GTC TTT GCT GAT GTT TCA-3' (扩增片段长449 bp). cerbB2基因引物序列: 正义链: 5'-GAA GGT GAA GGT GCT TGG ATC TGG-3'; 反义链: 5'-TAG CTC ATC CCC TTG GCA ATC TGC-3'(扩增片段长341 bp). VEGF引物序列为: 正义链: 5'-TGC CTT GCT GCT CTA CCT CC-3', 反义链: 5'-TCA CCG CCT CGG CTT GTC AC-3'(扩增片断VEGF121、165分别为540、410 bp). KDR引物序列为: 正义链: 5'-TAC CGG GAA ACT GAC TTG GCC T-3'反义链: 5'-TCA GTT CTT GCT GTA CAA TTT A-3'(扩增片断为440 bp). 人b-肌动蛋白(β-actin)作为内参照, 特异性扩增片段分别为660, 443和310 bp. 用一步快速热酚法[3]提取裸鼠原位移植瘤组织的总RNA, 紫外分光光度计定量并计算A260/A280比值, 计算RNA的纯度及完整性. 参照逆转录聚合酶链反应试剂盒说明书逆转录合成ras, cerbB2, VEGF, KDR及β-actin的cDNA. 在每一反应管中加样本cDNA 1 mL, 10×Buffer(缓冲液)(Mg2+ free) 2.5 mL, dNTP 2.5 mL, MgCl2 1.7 mL, 各引物正义链、反义链各0.5 mL, Tag酶1mL (5 mu/L), dd H2O 14.3 mL, 反应体系共25 mL, 经95 ℃变性, 5 min; 95 ℃变性40 s, 55 ℃退火40 s, 72 ℃延伸1 min, 扩增30个循环; 再72 ℃延伸, 10 min, 6 ℃保存, 2 min. PCR扩增产物行2 g/L琼脂糖凝胶电泳, 电压80 v, 30 min, EB染色显示特异性扩增产物, 以LD 2 000 DNA电泳Marker(外参照)作为分子质量参照, 在紫外灯下观察、摄片. 用Gis凝胶影像处理系统(上海天能科技有限公司)进行电泳道的纵向扫描, 根据每一泳道内各区带对光的吸收, 求ras, cerbB2, VEGF, KDR与β-actin带的比值, 加以统计分析.

2 结果
2.1 淋巴结及脏器转移

第1次动物实验4组共40只裸鼠, 术后第3 d死亡5只(表1). 第2次动物实验裸鼠共48只, 每组12只, 各组抑瘤率为: 化疗组49.3%, 中药组72.0%, 联合组75.0%. 淋巴结转移和肝转移的发生率与第1次实验结果相近.

表1 胃原位移植瘤瘤质量、抑瘤率及局部浸润转移(n).
分组n瘤重(g)抑瘤率(%)局部浸润近淋巴结远淋巴结肺脏肝脏脾脏
对照组102.3±0.810109776
化疗组81.1±1.0a51.3774335
中药组90.6±0.4a72.0875345
联合组80.7±0.5a70.1865445
aP<0.05, vs 对照组.
2.2 P21ras及P185两种癌基因蛋白表达

消痰散结方对人胃癌SGC-7901组织中P21ras及P185两种癌基因蛋白的表达有明显的下调作用(表2, 图1-4).

图1
图1 对照组P185蛋白表达情况.
表2 鼠原位移植瘤组织中两种癌基因蛋白表达的阳性强度.
分组nP21ras
P185
-++++++-++++++
对照组5024812626 (52.0)22814628 (56.0)
化疗组402945211 (27.5)a2836312 (30.0)a
中药组453346212 (26.7)a3147314 (31.1)a
联合组402837212 (30.0)a2935311 (27.5)a
aP<0.05, vs 对照组.
图2
图2 中药组P185蛋白表达情况.
图3
图3 对照组P21ras蛋白表达情况.
图4
图4 中药组P21ras蛋白表达情况.

扩增的ras、cerbB2基因片段在各组的阳性表达(见表3, 图5-6).

表3 ras cerbB2基因片段在各组的阳性表达情况(mean±SD).
分组nras/β-actincerbB2/β-actin
对照组101.11±0.210.59±0.11
中药组90.26±0.16b0.05±0.01a
化疗组80.74±0.19a0.08±0.02ad
联合组80.31±0.26a0.39±0.11d
aP<0.05,
bP<0.01, vs 对照组;
dP<0.01, vs 中药组.
图5
图5 鼠胃癌组织中ras mRNA的表达. ras扩增产物电泳条带
图6
图6 鼠胃癌组织中cerbB2 mRNA的表达. cerbB2扩增产物电泳条带
2.3 VEGF及其受体KDR及其mRNA表达

消痰散结方人胃癌SGC-7901组织中血管内皮细胞生长因子VEGF及其受体KDR的表达有下调作用(表4, 图7-10).

表4 胃癌组织中VEGF及其KDR的表达(60, mean±SD).
分组VEGF
KDR
阴性阳性率(%)阴性阳性率(%)
对照组951 (85.0)1743 (71.7)
化疗组2634 (56.7)b2931 (51.7)b
中药组4317 (28.3)bd4614 (23.3)bd
联合组4614 (23.3)bd4812 (20.0)bd
bP<0.01, vs 对照组;
dP<0.01, vs 化疗组.
图7
图7 对照组VEGF蛋白表达.
图8
图8 中药组VEGF蛋白表达.
图9
图9 对照组KDR蛋白的表达.
图10
图10 中药组KDR蛋白的表达.

血管内皮细胞生长因子VEGF及其受体KDR在各组mRNA的表达(见表5, 图11-12).

表5 各组胃癌组织中VEGF、KDRmRNA表达的比较(与β-actin的比值).
分组VEGF121VEGF165KDR
对照组0.615±0.0020.673±0.0030.455±0.005
化疗组0.579±0.004b0.630±0.003b0.429±0.004b
中药组0.450±0.002b0.522±0.002bd0.406±0.003bd
联合组0.448±0.004bd0.520±0.003bd0.402±0.003bd
bP<0.01, vs 对照组;
dP<0.01, vs 化疗组.
图11
图11 鼠胃癌组织中VEGFmRNA的表达.
图12
图12 鼠胃癌组织中KDRmRNA的表达.
3 讨论

祖国医学胃癌主要归属于"噎嗝"、"反胃"、"胃脘痛"等范畴. 现代药理实验研究发现消痰中药半夏、天南星具有抗癌作用[10-11], 消痰散结方是在消痰名方"导痰汤"的基础上化裁的, 生南星、生半夏为君药燥痰化湿, 消肿散结; 茯苓臣药, 健脾渗湿以制脾之生痰之源; 枳实、陈皮为佐药行气化湿. 方中生南星、生半夏具有消肿散结作用, 但南星、半夏力量尚嫌不足, 因为痰浊所致的肿瘤可上达巅顶, 下至涌泉, 流窜脏腑经络, 尚缺乏穿透络脉、化痰开结之力, 故消痰散结方还应用了全蝎、蜈蚣、川贝、白芥子、鸡内金等, 《玉楸药解》说全蝎能"穿筋透骨、逐湿除风", 具有以毒攻毒, 解毒散结, 消肿止痛的功效. 《医学衷中参西录》则认为蜈蚣走窜之力最速, 内而脏腑, 外而经络, 凡气血凝聚之处皆能开之, 性微毒, 而专善解毒, 凡一切疮疡诸能消之.全蝎、蜈蚣常相须配伍治疗瘿瘤肿块. 消痰散结方以生南星、生半夏燥湿化痰为君药, 伍以全蝎、蜈蚣通络消痰, 解毒散结以加强抑瘤作用也为君药. 再以利气豁痰的白芥子协助祛除阻于经络之痰湿, 川贝清热化痰, 托毒散结, 茯苓健脾渗湿, 三药共为臣药起协同增效作用. 《本草再新》言鸡内金能"化痰、理气、利湿", 在方中既能化痰, 又能健脾助运, 助药、食吸收, 与枳实、陈皮行气利湿共为佐药, 甘草为使药调和诸药, 起到消痰散结, 抗肿瘤转移的作用.

在胃大弯血管分布稠密处用空针头划破浆肌层, 用无齿镊将破损处向内推压, 使局部胃壁形成凹龛, 植入1块直径约1mm的瘤组织块于凹内, 用OB生物胶1-2滴粘贴, 迅速凝固后即可关腹[12-14]. 本实验发现给裸鼠作了上述处理后, 约3-4 wk左右, 模型鼠上腹可触及0.1-0.4 cm结节肿块, 8-10 wk时肿块明显增大, 局部包块透壁可见, 直径约1.0-1.9 cm大小, 表面呈结节状, 质地较硬. 发现裸鼠胃原位成瘤率100%, 组织病理学检查发现, 多数荷瘤鼠出现肝、胰腺等远处脏器转移, 部分出现血性腹水. 证明胃癌转移模型建立成功. 关于VEGF与胃癌浸润、转移及预后的关系, 文献[15-27]报道较多. c-erbB2基因增生和/或蛋白过度表达与胃癌恶性转化、胃癌发展有关[28-34]. 我们观察到, 消痰散结方具有抑制裸鼠原位移植人胃癌生长的作用, 中药组和联合组的抑瘤率分别为72.0%和70.1%, 达到了较好的抑瘤效果. 同时, 消痰散结方还能减少肿瘤局部浸润、淋巴结转移、重要脏器如肺、肝、脾等的转移. 其作用机制的研究发现消痰散结方组胃癌组织中的VEGF, KDR, 癌基因cerBb2, ras无论在蛋白水平还是mRNA水平都有不同程度的下调. 因此, 消痰散结方抑制肿瘤肿瘤生长和转移的作用机制可能是多方面的, 消痰散结方可能是通过影响肿瘤新生血管的生成, 下调VEGF和KDR的表达, 通过降低肿瘤转移相关基因cerBb2、ras的表达而抑制了肿瘤转移的作用.

中医理论认为消痰可以影响痰的"易行"和"易聚", 散结则可能有利于消除结块. 而本研究已发现消痰散结可以下调肿瘤转移相关因素如VEGF, KDR, cerBb2和ras. 然而, "痰"、"结"是如何形成肿瘤, 他们与癌基因和肿瘤血管形成之间到底存在怎样的关系, 尚有待于进一步探讨.

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