0 引言
乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种, HBV DNA的长度为3.2 kb, 具有4个开放读码框架(ORF), 分别编码HBV的表面抗原蛋白、核心/e抗原蛋白, X蛋白以及HBV DNA聚合酶(HBV DNA P)[1]. HBV DNA P基因在ORF中最长, 并且与C、S、X基因区有重叠, 其编码的P蛋白含有3个功能域和1个无意义的隔离片(spacer), 目前对聚合酶及其所编码的各个功能区域蛋白质的功能的认识虽然还不是很清楚, 但已经取得了一定的进展.
1 HBV DNA P RNase H结构和功能
嗜肝病毒逆转录酶(聚合酶)含有的4个结构域, 排列顺序为N-末端蛋白(TP), 隔离片(spacer, SP), 逆转录酶(RT)/DNA多聚酶和RNase H. 各区段分别在2 307-2 840 nt、2 841-0-132 nt、133-1 128 nt、1 129-1 621 nt[2]. TP和SP对嗜肝病毒聚合酶是独特的, TP内的第96位酪氨酸残基可引导DNA合成, 并使聚合酶与病毒DNA共价结合, SP无已知的功能, 只是将末端蛋白和其他分子连接起来, 逆转录酶(RT)和RNase H包含两个已知的酶活性位点, 后二者与其他相关的逆转录病毒和逆转录因子的聚合酶是一致的[3-14]. Kim et al 对人HBV聚合酶的N-末端或C-末端和结构域同时删除形成变异株, 并将变异株和野毒株一起在大肠杆菌中表达, 经直链淀粉柱层析法纯化后, 二者纯化蛋白的DNA依赖性的DNA聚合酶活性进行比较, 证明TP或隔离片删除分别可以使酶活性减少到70%, 而RNase H删除对聚合酶活性的影响要大于前二者, 单个DNA聚合酶或DNA 聚合酶N-末端删除仍能保持酶活性, 说明就HBV多聚酶的聚合活性而言, 小的结构域的聚合活性要小于聚合酶结构域的活性[15]. Lin et al研究两个自然发生的HBV颗粒(isolates) 56和2-18, 核酸序列有98.7%的同源性, 但是复制效率不同. 转染到HepG2细胞后, 从56转染细胞的细胞内病毒核心颗粒分离出的HBV DNA明显高于2-18. 用功能域基因替代法研究二者复制效率差异的结构基础. 将2-18中的完整P基因和TP、SP、RT和RNase H 分别用56相应区域替代形成全长嵌合基因组. 细胞转染分析提示, 2-18的全部P基因组用56的P基因替代使病毒复制轻度增强. 惟一获得像56颗粒体的高复制效率的嵌合基因组是用56的RT替代2-18的RT的基因组. 在RT区域内, 2-18与56的氨基酸差异在617位(蛋氨酸对亮氨酸), 652位(丝氨酸对脯氨酸), 682位(缬氨酸对亮氨酸). 652位氨基酸上的点突变是这种复制效率差异的原因. HBV RT结构域的同源性模型研究提示652位氨基酸残基从脯氨酸到丝氨酸突变可能影响对模板-引物相互作用的HBV RT的构造, 导致多聚酶活性减弱[16]. Kim et al将人的HBV聚合酶在兔网状细胞裂解系统中表达. 表达蛋白显示出DNA依赖性的DNA聚合酶活性, 在体外转录和翻译产生分子量大约100 kD的大蛋白. HBV DNA聚合酶可以被阿菲迪霉素(抗病毒抗生素)和NEM抑制, 在pH7.5和温度37 ℃时聚合反应最佳, 同时, 聚合酶活性需要有MaCl2 或MgCl2(MnCl2更佳). 在75 mM NaCl 或 100 mM KCl存在时活性较好(75 mM NaCl更佳)[17]. 目前, 兔网织红细胞裂解液(RRL)是惟一能在体外试验条件下产生由病毒逆转录酶(P蛋白), pgRNA的RNA茎环结构(ε)和细胞蛋白共同组成的核蛋白复合物, 进行DHBV P蛋白的翻译的体系. 这一系统也能提供必要的因子. 然而, 他有限的翻译能力限制了对蛋白复合物的深入研究. 为克服这种限制, Beck et al先在大肠杆菌内表达产生大量的DHBV P蛋白, 然后再在RRL中的进行核蛋白复合物的重构. 因为以往在细菌中产生全长P蛋白的尝试没有成功, 于是单独在大肠杆菌中表达TP和逆转录酶-RNase H(RT-RH). 结果TP和C末端经微小修改后的RT-RH, 也能有相当量的表达, 当加入到RRL时, 能进行ε-依赖性DNA引物合成, 证明翻译后的活化[18]. Lott et al用昆虫细胞同时感染独立表达核心蛋白和多聚酶的杆状病毒. 结果发现核心蛋白与多聚酶相互作用的特征之一是核心蛋白与表达全长的多聚酶及多聚酶的TP、RT、RNase H每个区域共同沉淀. 其中构建了迷你RNase H (FRNH)质粒, 氨基酸范围在 680-780 aa, 含有一个 FLAG 抗原决定基. 用抗-FLAG抗体与FRNH免疫沉淀, Western blot分析抗-FLAG和抗核心抗体, 证明核心蛋白与迷你RNase H多肽共沉淀[19].
2 RNase H与细胞因子
嗜肝病毒逆转录酶与前基因组RNA模板上的RNA信号ε特异结合, 并且靠RT自身引导(蛋白引导). 蛋白引导不仅需要病毒逆转录酶和εRNA 模板, 也需要特异的宿主细胞因子(细胞蛋白), 包括热休克蛋白HSP90, 多种共陪伴(cochaperone)蛋白, 还有一些不清楚的成分共同组成的核蛋白复合物. 有功能的复合物催化合成短链DNA引物, 该引物又作为ε与TP共价结合的模板. Cho et al 认为HSP90及其相关产物在DHBV感染通过RNA信号ε与DHBV聚合酶结合对DHBV复制起重要作用. 同理, 用兔网状细胞裂解液中合成人HBV聚合酶蛋白在体外与HSP90形成联合体, HSP90 用MBP共纯化, 聚合酶蛋白在HepG2细胞中表达, 提示在体内人的HBV聚合酶与HSP90相关. 为了对HSP90的作用位点进行定位, HBV聚合酶翻译的几个删除突变与抗HSP90抗体在体外共沉淀, 结果提示TP的C-末端和RT单独与HSP90发生作用[20]. HBV聚合酶单独与HSP90的N-末端和C-末端相互作用, HSP90的N-末端片段(1-302 aa)与HBV聚合酶的TP和RP都有相互作用, 而C-末端片段(438-723 aa)仅与RT相互作用, 其中间片段(327-438 aa)则与HBV聚合酶无相互作用[21]. Hu et al构建两个迷你RT(miniRT)表达片段, pcDNA-miniRT1(miniRT1)将改建后的DHBV RT多肽的N-末端(1-17 aa), C-末端(734-786 aa), 隔离片(245-352 aa)切除, 含564 aa(野毒株786 aa), pcDNA-miniRT2 (miniRT2)在miniRT1基础上将C-末端进一步截短(575-786 aa), 含394 aa. MiniRT1 与野毒株RT一样具有蛋白引导功能, MiniRT2 具有完整的ε结合的活性, 但是仅有极少的蛋白引导活性(为野毒株的1%-5%). 这两个mini-RT蛋白含有与HSP90和p23相关的结合域. 结果 (1) HSP90 能识别TP和RT域上的两个特异区域, 含有两个陪伴结合区域的mini-RT蛋白保留了全部的ε结合活性, RT和RNase H 区域外的序列在蛋白引导时起作用, 很可能在催化DNA合成时需要. (2)在体外用高浓度的盐和非离子洗涤液使RT和细胞因子(HSP90)解离, 单独表达RT, 纯化的RT失去了ε结合和蛋白引导的功能. 但含有HSP90和ATP的网状细胞裂解液能恢复这种功能. HSP90对RT与RNA的结合, 不仅起到建立的功能, 而且还有维护的功能. (3)在RT合成过程中不需要HSP90, 但HSP90可激活转译后的RT [22]. DHBV RT需要宿主细胞因子的辅助进行RT与ε的特异结合和蛋白引导功能.RT与ε交互作用和蛋白引导需要HSP90. HSP90的几个辅因子在体外足以保持重组DHBV RT的ε结合和蛋白引导活性, 重组RT活性需要HSP90、HSP70、HSP40、Hop/p60四种蛋白, 蛋白p23可进一步提高重组RT的动力学. RT 被陪伴蛋白激活是一个动力学过程, 需要ATP水解和HSP90 ATP酶活性. HSP90 和HSP70是ATP酶, 在ATP结合和水解时易于折叠, HSP40能刺激HSP70的ATP酶活性和调节HSP70的伴护功能. p60能与HSP90 和HSP70结合, p23, 小的, 酸性磷蛋白质, 与HSP90结合, 进一步提高重组动力学. 说明对RT活化来说, 宿主因子的最小补充是必要的和充分的. 两个截短的迷你型DHBV RT与谷胱苷肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白GST-miniRT1和GST-miniRT2, 在大肠杆菌中表达并纯化, 另外还构建了有两个氨基酸替换而不能与εRNA结合的突变型MiniRT2/CA29和在RT的活性位点两个氨基酸替换(YMDD变成YMHA), 使RT 失去活性的MiniRT1/YMHA. 在重构蛋白引导反应中, 显示在兔网织红细胞裂解液中, 依靠HSP90的存在, GST-miniRT1在体外有强烈的蛋白引导活性. 用已知的HSP90陪伴联合体的组成成分代替兔的网状细胞裂解物, 刺激蛋白引导, 结果HSP90、HSP70、Hop、Ydj1(HSP40), 在一起能重新组成蛋白引导反应, 单独或任何两个或三个蛋白组合是无效的, 偶尔HSP70加Ydj1能微弱刺激蛋白引导反应, 但比四种相加效力小得多. 同时, 这种蛋白引导反应与陪伴蛋白浓度呈正相关. 四种纯化的陪伴蛋白重新组成的蛋白引导活性较网状细胞裂解物要低, 可能是二者动力学差异所致. 适当延长作用时间, 可以使陪伴蛋白的引导活性提高. p23可以提高蛋白引导的重新组成. 与RT的催化活性有关, 失去了活性位点的突变RT完全没有蛋白引导的作用[23]. Park et al研究证明HSP90可以被抗-HSP90抗体抑制; 在体外HSP90被含有1%NP-40的1 M氯化钠解吸后几乎完全失去了对在昆虫细胞内表达的HBV聚合酶的引导活性. 人HBV聚合酶与前基因组RNA结合与鸭HBV聚合酶不同, HSP90 不仅维持人HBV聚合酶与前基因组RNA结合的联合体, 而且使HBV聚合酶能胜任在体外引导作用. HSP70是HSP90 联合体组成成分, 但HSP70可能直接与HBV聚合酶结合不需要HSP90参与[24]. 构建杆状病毒载体pFPolE, 编码人HBV聚合酶开放读码框架(ORF)和3'-非翻译区(NTR)含有DR2、DR1和ε茎环, ε茎环对引导HBV复制起模板作用. 构建的含HBV 聚合酶的重组质粒经M2琼脂珠纯化, SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染后, 可得一条约60 kDa的蛋白质带, 经N-末端氨基酸测序及BLAST程序进行同源性分析, 然后进行免疫斑点分析和体外引导试验, 结果提示陪伴蛋白(chaperonin)HSP60与HBV Pol之间有特异性的相互作用关系. HSP60与HBV聚合酶相互作用, 是使HBV聚合酶变成活性状态的重要阶段. HSP60在体外强烈影响HBV聚合酶活性. (1)通过蛋白特异性抗体封闭HSP60, 可降低HBV聚合酶活性; (2)在ATP存在的情况下增加HSP60, 可提高聚合酶活性; (3)ATP与HSP60共同激活HBV聚合酶. 体内试验显示, 通过C△540(变异的HSP60)抑制细胞内的HSP60, 可导致HBV聚合酶活性的降低. 因此, HSP60与HBV聚合酶相互作用对激活HBV聚合酶是有明显意义的[25]. 进一步在昆虫细胞中使用重组杆状病毒表达聚合酶的几个删除突变的蛋白质, 然后用M2免疫共沉淀, 显示HSP60结合到HBV P需要两个在Pol上的最小位点: TP(1-199 aa)和RH(680-842 aa).在人的HBV宿主细胞HepG2中显示HBV Pol也可以与HSP60结合; HSP60通过与TP和RH位点结合激活HBV Pol, 而Pol与HSP60结合不需要前基因组RNA[26].
3 RNase H与病毒复制
Walton et al 认为核糖核酸酶(RNase H) 在HBV复制过程中能识别并有效裂开DNA-RNA杂交的RNA链, 但是缺乏序列选择性. 然而, DNA-RNA杂交链的构成又需要特异性的序列识别.在这种前提下, 为了解与靶RNA(共价连接到RNase H)互补的反义寡核苷酸能否用于引导RNase H进行特异性杂交链的裂开. DNA寡核苷酸与RNase H联合使得核糖核酸酶活性对HBV mRNA具有特异性. 一个改良的, 对HBV mRNA的DR1是特异性的13碱基寡核苷酸, 用水溶性交联剂与改良的大肠杆菌RNase H 连接. 含1 200碱基, 包括DR1的HBV RNA片段被合成作为T7 RNA聚合酶的底物. RNase H-寡核苷酸交联物与HBV mRNA裂开产生的RNA片段在不同浓度下发生反应, 在最合适条件下85%的底物裂开, 用于对照的包括单用RNase H、寡核苷酸和无裂解活性的不相关的mRNA底物. RNase H与HBV反义寡核苷酸连接能特异性裂解靶HBV片段[27]. HBV虽然是DNA病毒, 但其复制需要HBV多聚酶基因编码的逆转录酶, 而HBV多聚酶的生化结构不能从核壳体释放酶活性蛋白. Qadri et al用酵母为基础的遗传学方法表达HBV逆转录酶. 通过HBV逆转录酶基因替代酵母逆转座子(retrotransposon )Ty1 成分的逆转录酶产生杂交的Ty1/HBV . 另外, 构建了与杂交Ty1/HBVRT的转录物反义方向的指示基因his3AI. his3AI 的拼接、Ty1/HBVRT RNA cDNA 的合成及整合都依赖于逆转录酶的活性, Ty1/HBVRThis3AI 转录物被同源性重组或整合酶介导的插入和之后的HIS3 基因的表达, 由一系列的逆转录产生的组氨酸原养型微生物(prototrophs)产物. 用这种方法成功地检测内源性Ty1表达缺陷的酵母菌中HBV逆转录酶活性, 同负链DNA合成的具有蛋白引导活性的HBV多聚酶是一致的. HBV逆转录酶或RNase H的删除, 可以导致组氨酸原养型微生物的明显减少, 在体外由逆转录酶刺激的病毒样颗粒内HBV编码的HBx 蛋白成倍增加. 再者, 在拉米夫定存在条件下, 没有观察到组氨酸原养型微生物(His protrophs)的酵母组氨酸(yeast His+)生长. 因此, 这种在酵母中基因选择的方法, 是安全、经济、可靠的的方法, 具有大量进行辅因子和HBV多聚酶功能抑制剂筛选的潜力[28].
