银杏叶提取物抗大鼠肝纤维化的作用

摘要

目的: 探讨银杏叶提取物对实验性大鼠肝纤维化的预防及治疗作用机制.

方法: 采用四氯化碳腹腔注射诱导的大鼠肝纤维化模型, 60只Wistar大鼠分为5组: 模型组、银杏叶干预组、银杏叶治疗组、银杏叶组, 另设正常对照组, 应用HE染色观察大鼠肝组织的改变及Von-Gieson胶原纤维特殊染色观察肝纤维化程度, 并采用免疫组织化学染色法及RT-PCR法检测肝组织I型胶原、TGF-1蛋白和mRNA的表达.

结果: 银杏叶干预及治疗组与模型组相比肝组织结构明显改善、纤维化增生程度减轻; 肝组织内I型胶原、TGF-1的含量(I型胶原: 0.2 563±0.0 009 vs 0.2 885±0.0 025, 0.2 541±0.0 076 vs 0.2 885±0.0 025, P<0.01; TGF-1: 0.2 785±0.0 012 vs 0.3 015±0.0 012, 0.2 791±0.0016 vs 0.3 015±0.0 012, P<0.01)以及mRNA的表达均明显低于模型组(I型胶原: 0.0 778±0.054 vs 0.2 361±0.113, 0.1 075±0.007 vs 0.2 361±0.113, P<0.01; 0.523±0.015 vs 0.956±0.049, 0.524±0.009 vs 0.956±0.049, P<0.01); 银杏叶组与正常对照组之间无差异.

结论: 银杏叶提取物可抑制肝星状细胞激活和转化, 下调I型胶原、TGF-1蛋白质及其mRNA的表达, 从而抑制或逆转纤维化形成.

关键词: N/A

Effects of Ginkgo biloba extract on liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats

Wei Hu, Zhao-Hong Shi, Ting-Fang Ma, Jie-Ping Yu

Wei Hu, Ting-Fang Ma, Jie-Ping Yu, Department of Gastroenterology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Zhao-Hong Shi, Department of Gastroenterology, Wuhan First Municipal Hospital, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Supported by: the Youth Chenguang project of Science and Technology of Wuhan City, No. 20025001023.

Correspondence to: Wei Hu, Department of Gastroenterology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China.

Received: November 5, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 8, 2003
Published online: April 15, 2004

Abstract

AIM: To study the effects of Ginko biloba extract (EGb) on hepato-fibrosis induced by carbon tetrachloride (Cl₄) in rat model.

METHODS: Rat liver fibrosis model was induced by Cl₄ administration. Wistar rats were randomly divided into 5 groups: normal control group, a model group, a interven-tional group, a therapeutic group, and a EGb group. The EGb interventional group, apart from administration of Cl₄, was treated concurrently with EGb 0.3 g/kg, ig once a day; the EGb therapeutic group was treated with EGb 0.3 g/kg, ig once a day after cirrhosis was induced successfully, and the EGb group was treated only with EGb 0.3 g/kg, ig once a day. At the end of wk 8 and 16, all the rats were sacrificed. The pathological changes of liver were observed by H-E and Von-Gieson staining.The expression of mRNA and proteins of collagen I/TGF₁ in liver were determined by RT-PCR and immunohistochemistry.

RESULTS: The degree of liver fibrosis and level of mRNA and proteins of collagen I/TGF₁ in liver were significantly reduced in the EGb interventional and therapeutic groups compared with those in the model group (type I collagen mRNA: 0.0 778±0.054 vs 0.2 361±0.113, 0.1 075±0.007 vs 0.2 361±0.113, P < 0.01; type I collagen proteins: 0.2 563±0.0 009 vs 0.2 885±0.0 025, 0.2 541±0.0 076 vs 0.2 885±0.0 025 , P < 0.01; TGF₁ mRNA: 0.523±0.015 vs 0.956±0.049 , 0.524±0.009 vs 0.956±0.049, P < 0.01; TGF₁ proteins: 0.2 785±0.0 012 vs 0.3 015±0.0 012, 0.2 791±0.0 016 vs 0.3 015±0.0 012, P < 0.01).The EGb group had the same results as the normal control group.

CONCLUSION: EGb has prophylactic and therapeutic effects on CCl₄-induced rat liver fibrosis, probably through its anti-lipoperoxidation, suppressing the activation of hepatic stellate cells and transition and reducing the synthesis of hepatic type I collagen and TGF₁.

Key Words: N/A

0 引言

肝纤维化是一切慢性肝病发展至肝硬化的必经之路, 是由于肝脏细胞外基质(ECM)合成和降解失衡, 最终引起ECM过渡沉积所致[1-8]. 其中转化生长因子1(TGF-1)被认为是肝纤维化形成过程中重要的始动刺激因子之一[9-12]. 虽然普遍认为肝纤维化在一定条件下是可以逆转的, 但至今仍缺乏有效的抗纤维化药物. 银杏叶提取物(EGb)主要药理成分为黄酮甙和银杏内酯, 具有广泛的生物学作用[13-18], 主要包括清除氧自由基、抑制脂质过氧化、改善微循环等. 银杏叶提取物具有防止肝损伤, 治疗肝纤维化的作用[19]. 我们选用CCl₄诱导的大鼠肝纤维化模型, 旨在进一步探讨EGb抗肝纤维化作用的机制, 为EGb的临床应用提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级, ♂Wistar大鼠60只, 体质量160±20 g, 购于湖北省实验动物中心; EGb由武汉市一医院中药制剂室提供, 经湖北午时药业股份有限公司检验, 编号02-391; CCl₄, 郑州化学试剂二厂产品; I型胶原、TGF-1 多克隆抗体及兔抗鼠SP试剂盒为北京中山生物制品公司产品; Trizol购自Gibco公司; 逆转录酶MMLV, Oligo(dT)18, Tac酶, MixdNTP均为Promega公司产品; RNA酶抑制剂为大连宝生物工程有限公司产品; TGF1和I型胶原及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因引物序列为TGF1: 上游 5'-TGAGTGGCTGTCTTTTGA CG-3', 下游5'-ACTTCC AACCCAGGTCCTTC-3'; I型胶原: 上游 5'-TACTACCGGGCCGATGATGC-3', 下游5'-TCCTTGGGGTTTGGGCTGATGTA-3'; GAPDH: 上游5'-TCCCTC AACATTGTCAGCAA-3', 下游5'-AGCTCCACAACGGATACATT-3', 均由上海生物工程制品公司合成; HPIAAS-2000彩色图文分析系统; Biotra PCR扩增仪, Eppendorf低温离心机, 紫外分光光度仪等; Eppendorf 低温离心机, Biometra UNOII PCR扩增仪, PE-Lamda 25UV紫外分光光度计, HW-8B型超级微量恒温器, Bio-Rad 电泳仪, Bio-Rad GELDOC-2000紫外凝胶成像系统.

1.2 方法

将60只大鼠随机分为5组: 正常对照组10只, 模型组18只, 银杏叶干预组12只, 银杏叶治疗组14只, 银杏叶组6只, 各组间暴露因素无差异. 模型组、干预组及治疗组均给予CCl₄＋石蜡油1: 1(V: V)混合, 腹腔注射8 wk, 1 mL/kg, 2次/wk. 干预组同时给予银杏叶制剂悬浊液0.3 g/kg灌胃, 1次/d. 模型组和治疗组在8 wk中共有6只死亡. 此后治疗组给予银杏叶制剂悬浊液0.3 g/kg灌胃, 1次/d, 共8 wk. 正常对照组给予生理盐水1 mL/kg, 腹腔注射8 wk. 银杏叶组仅给予银杏叶制剂悬浊液0.3 g/kg, 1次/d. 实验总周数为16 wk. 所有的动物都给予自来水及标准大鼠饲料喂养, 每12 h灯照及黑暗交替. 最后1次用药后3 d处死大鼠. 肝脏标本取右叶相同的部分以40 g/L甲醛固定, 3 d内石蜡包埋备组织病理学检测; 余下肝脏于液氮中速冻、-80 ℃冰箱内保存, 备肝组织匀浆测组织生化、抽提组织RNA.

1.2.1 病理学研究: 肝组织分别用HE染色和Von-Gieson胶原纤维染色法检测肝纤维化组织病理学, 按照改良Knodell评分标准[20]进行纤维化程度评估: 0级, 无纤维化; 1级, 汇管区扩大, 轻度纤维化; 2级, 汇管区周围纤维化, 纤维隔形成, 小叶结构保留; 3级, 纤维隔伴小叶结构紊乱, 无肝硬化; 4级, 早期肝硬变或肯定的肝硬化. 肝组织I型胶原、TGF-1蛋白的免疫组化采用PAP法DAB显色. I型胶原、TGF-1表达程度应用HPIAAS-2000彩色医学图像分析仪, 对各组切片随机选取10个视野测量其光密度值, 取其平均值作为该切片的平均光密度值(MOD).

1.2.2 I型胶原、TGF-1mRNA表达: 取50-100 mg左右冻存标本放入0.5 mL玻璃匀浆器中加Trizol 1 mL室温下匀浆, 抽提组织RNA, 加氯仿0.2 mL, 4 ℃, 12 000 g下低温离心15 min, 取上清加等体积异戊醇 4 ℃, 12 000 g下低温离心10 min, 750 mL/L乙醇1 mL洗涤, 加dd H₂O 30-50 L, 55-60 ℃温浴10 min. 紫外分光光度仪检测吸光度A值. -80 ℃冰箱内保存. 取RNA 2 g加上dd H₂O及Oligo (dT) 1 L置于70 ℃水浴箱内5 min, 冰上5 min, 加MMLV buffer, dNTP, RNA酶及其抑制剂、ddH₂O共25 L, 于42 ℃温浴90 min. 反应总体积为25 L, 含Taq酶Buffer 2.5 L, d NTP Mix (2.5 moL/L) 2 L, Taq酶1 U, Pimer (mix)1 L, c DNA 1 L, 加双蒸水达25 L体系混匀后离心15 s. TGF1的扩增条件: 95 ℃ 3 min 预变性, 开始循环: 95 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s. 共循环 35次, 最后彻底延伸于72 ℃ 7 min, 4 ℃保存, 扩增产物长度为350 bp. I型胶原的扩增条件: 95 ℃ 3 min 预变性, 开始循环: 95 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s. 共循环 35次, 最后彻底延伸于72 ℃ 7 min, 4 ℃保存, 扩增产物长度为317 bp. GAPDH的扩增条件: 95 ℃3 min 预变性, 开始循环: 95 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s. 共循环 35次, 最后彻底延伸于72 ℃ 7 min, 4 ℃保存, 扩增产物长度为309 bp. PCR产物经2%琼脂糖凝胶, 25 mV, 50 mA下电泳. 电泳结果经Fluros-Multimager扫描仪扫描成像. 用Multi-Analyst software package进行PCR产物半定量, TGF1和I型胶原mRNA相对含量用TGF1和I型胶原的积分光密度值与GAPDH的积分光密度值的比值表示.

统计学处理 计量资料以mean±SD 表示. 应用SPSS 1.0统计软件包处理分析. 纤维化程度以等级资料表示, 并采用Ridit检验进行分析. P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 肝组织病理学

模型组HE染色可见多数正常肝小叶结构破坏或消失, 由汇管区伸出较粗大的胶原纤维条索, 分割、包绕肝小叶形成假小叶, 肝细胞索排列紊乱, 肝细胞浊肿明显, 并见广泛的脂肪变性, 部分肝细胞坏死. 纤维隔内有大量单核、淋巴、嗜酸性细胞及成纤维细胞浸润; VG胶原染色可见红色胶原纤维大量增生, 汇管区-中央静脉区纤维间隔宽大, 增生的肝细胞被胶原纤维包绕、分割成大小不等的假小叶, 部分肝脏已形成典型肝硬化的改变. 银杏叶干预组肝细胞有不同程度变性、坏死, 汇管区及小叶间有少量纤维组织增生, 与模型组比较差异显著, 肝纤维化程度计分显示与模型组有明显差异(P<0.05); 治疗组肝细胞也有不同程度变性、坏死, 汇管区及小叶间有少量纤维组织增生, 部分向小叶内伸展, 纤维间隔变细, 肝纤维化程度计分也显示与模型组有明显差异(P<0.05, 表1, 图1).

表1 各组大鼠肝纤维化程度分级比较.

组别	n	肝纤维化分级
		0级	Ⅰ级	Ⅱ级	Ⅲ级	Ⅳ级
正常对照组a	12	12	0	0	0
模型组	14 (4/18)	0	0	1	5	8
干预组a	12	0	4	6	2	0
治疗组a	12 (2/14)	0	4	5	3	0
银杏叶组a	6	0	0	0	0	0

^aP<0.05 vs 模型组.

图1 各组大鼠肝组织病理变化. A: 模型组大鼠肝组织HE染色 ×100; B: 银杏叶干预组大鼠肝组织HE染色×100; C: 银杏叶治疗组大鼠肝组织HE染色 ×100; D: 模型组大鼠肝组织VG染色 ×100; E: 银杏叶干预组大鼠肝组织VG染色×100; F: 银杏叶治疗组大鼠肝组织VG染色×100.

2.2 TGF-1和 I型胶原蛋白表达

正常对照组和银杏叶组肝组织几乎不表达TGF-1, 模型组TGF-1阳性细胞主要位于中央小叶和门静脉周围纤维带及肝纤维间隔中, 主要见于Kuffer细胞、类间质细胞质及其周围; EGb干预及治疗组阳性染色程度较模型组明显减轻. 正常对照组和银杏叶组肝组织I型胶原蛋白主要存在于中央静脉、门脉区三联管管周及管间纤维组织, 模型组I型胶原阳性细胞染色明显增多, 除汇管区、中央静脉周围增多外, 在纤维间隔内弥漫分布; 而EGb干预及治疗组I型胶原蛋白主要位于中央静脉和门静脉周围纤维带(表2, 图2).

表2 各组大鼠肝组织I型胶原及TGF-1蛋白表达的比较(mean±SD).

分组	n	I型胶原	TGF-1
正常对照组	10	0.2625±0.029b	0.2723±0.0089b
个模型组	14 (4/18)	0.2885±0.0025	0.3015±0.0012
干预组	12	0.2563±0.0009b	0.2785±0.0012b
治疗组	12 (2/14)	0.2541±0.0076b	0.2791±0.0016b
银杏叶组	6	0.2632±0.026b	0.2733±0.0078b

^bP<0.01 vs 模型组.

图2 I型胶原、TGF-β1在各组大鼠肝组织中的表达. A: I型胶原在模型组大鼠肝组织表达×100; B: I型胶原在银杏叶治疗组大鼠肝组织表达×100; C : I型胶原在银杏叶干预组大鼠肝组织表达×100; D: TGF-b1在模型组大鼠肝组织表达×100; E: TGF-β1在银杏叶治疗组大鼠肝组织表达×100; F: TGF-β1在银杏叶干预组大鼠肝组织表达×100.

2.3 I型胶原和TGF-1mRNA表达

模型组肝组织I型前胶原、TGF-1 mRNA相对含量显著高于正常对照组、银杏叶组、EGb干预及治疗组(P<0.01, 表3, 图3); 正常对照组、银杏叶组、EGb干预及治疗组的I型前胶原、TGF-1 mRNA相对含量无明显差异(P>0.05).

表3 各组大鼠TGF1和I型胶原mRNA的表达比较(mean±SD).

分组	n	I型胶原/A	TGF-1/A
正常对照组	10	0.047±0.05c	0.507±0.003c
模型组	14(4/18)	0.236±0.113	0.956±0.049
干预组	12	0.078±0.054c	0.523±0.015c
治疗组	12 (2/14)	0.108±0.007c	0.524±0.009c
银杏叶组	6	0.057±0.063c	0.536±0.017c

^cP<0.001 vs 模型组.

图3 I型胶原、TGF-β1mRNA在各组大鼠肝组织中的表达. A: 各组大鼠肝组织GAPDH mRNA电泳条带; B: 各组大鼠肝组织I型胶原mRNA电泳条带; C: 各组大鼠肝组织TGF-β1 mRNA电泳条带.

3 讨论

肝星状细胞(HSC)活化是肝纤维化发生的核心环节, 氧化应激及脂质过氧化是引起肝细胞损伤与HSC活化的重要机制[21-26]. 肝损伤产生的氧自由基及细胞因子等激活HSC, 产生大量以I型胶原为主的间质胶原, 引起细胞外基质(ECM)数量和质量上的变化, 最终导致肝纤维化的发生[27-31]. 因此, 抑制HSC的激活, 减轻细胞因子对其的影响成为防治肝纤维化的关键. 银杏叶提取物(EGb)是天然的血小板活化因子拮抗剂. 其主要成分银杏黄酮甙类有较强的抗氧化作用[13-17]. 黄酮苷的母核中含有还原性羟基功能基团, 可直接清除O₂^-,/OH, H₂O₂等氧自由基, 并能捕获脂质自由基、脂过氧自由基、脂氧自由基和烷自由基等基团, 终止自由基连锁反应链, 从而抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应, 抑制MDA、共轭二烯等毒性物质的生成, 增强自由基反应酶类如SOD, GST-PX等的活性, 减缓氧自由基和脂质过氧化损伤. 国内已有资料表明[19], EGb通过抗氧化应激抑制NF-B诱导的HSC活化, 抑制肝纤维化的发生.

我们利用CCl₄诱导实验性肝纤维化模型, 同时用EGb干预和治疗, 结果显示, 实验性大鼠腹腔注射CCl₄ 8 wk后肝表面可见大小不一的颗粒, 镜下可见胶原纤维大量沉积于汇管区, 围绕肝再生结节, 成功诱导出肝纤维化. 干预组8 wk后大鼠均无明显肝纤维化形成, 与正常对照组相比, 除肝细胞排列紊乱外, 汇管区无胶原纤维沉积; 治疗组8 wk后肝纤维化的程度也明显改善, 汇管区及小叶间仅有少量纤维组织增生, 部分向小叶内伸展, 证实EGb具有防治CCl₄诱导实验性肝纤维化的作用. 免疫组化则显示正常对照组及银杏叶组I型胶原的表达仅见于汇管区, 而模型组中, I型胶原阳性细胞染色明显增多, 其分布除汇管区、中央静脉周围增多外, 在肝纤维隔内也呈弥漫分布, EGb干预及治疗组I型胶原阳性细胞免疫组化染色程度明显弱于模型组; 正常对照组及银杏叶组TGF1几乎不表达, 模型组TGF-1阳性细胞主要位于中央小叶和门静脉周围纤维带及肝纤维间隔中, EGb干预及治疗组阳性染色程度较模型组明显减轻. 同样, 利用RT-PCR检测肝组织I型胶原和TGF1 mRNA的相对含量也表明正常及EGb组大鼠的表达很弱, 而模型组I型胶原和TGF1 mRNA显著增强, EGb干预及治疗组则明显低于模型组, 二者有显著差异(P<0.0 001). 提示EGb可能通过减轻氧自由基和脂质过氧化对肝细胞的损伤, 抑制HSC的增生, 减少 TGF-1 mRNA的表达, 从转录水平降低了I型胶原mRNA的生成, 最终抑制/逆转肝纤维化的发生, 并且无毒副作用. 此为EGb应用于肝纤维化的防治提供了理论依据.

备注

编辑: N/A

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