病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-04-15; 12(4): 859-861
在线出版日期: 2004-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i4.859
重组人肝再生增强因子对小鼠CCl4中毒性肝损伤的治疗作用
王永华, 成军, 洪源, 王琳, 刘妍, 张健, 李克
王永华, 中国人民解放军总医院消化内科 北京市 100853
成军, 洪源, 王琳, 刘妍, 张健, 李克, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 北京市 100039
王永华, 男, 1963-02-16生, 浙江东阳人, 汉族, 1994年军医进修学院内科消化专业硕士学位, 副主任医师, 主要从事内科消化疾病临床及肝脏疾病的基础研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, No. C39970674, No. C30371288; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15

目的: 利用大肠杆菌的基因工程技术, 制备重组的人肝再生增强因子(ALR)药物, 对于CCl4肝损伤的小鼠模型进行治疗, 评价重组的人肝再生增强因子在肝损伤治疗中的效果和价值.

方法: 应用大肠杆菌系统, 表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白. 利用四氯化碳法制备肝细胞损伤的动物模型, 以重组的人肝再生增强因子药物进行治疗, 以生理盐水治疗作为对照, 比较治疗后血清ALT, AST水平的变化, 评价重组的人肝再生增强因子对于肝损伤的治疗作用.

结果: 成功制备了重组的人肝再生增强因子药物, 纯度在98%以上. 成功制备了四氯化碳的小鼠肝损伤模型, 经过重组的人肝再生增强因子药物治疗后, 血清中ALT, AST水平都有显著的下降(ALT: 991 U/L对2 134 U/L, P<0.01; AST: 938 U/L对1873 U/L, P<0.01).

结论: 重组的人肝再生增强因子药物, 有希望成为各种原因引起的肝细胞损伤的治疗药物.

关键词: N/A
引文著录: 王永华, 成军, 洪源, 王琳, 刘妍, 张健, 李克. 重组人肝再生增强因子对小鼠CCl4中毒性肝损伤的治疗作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(4): 859-861
Therapeutic effects of recombinant human augmenter of liver regeneration on murine liver damage caused by carbon tetrachloride
Yong-Hua Wang, Jun Cheng, Yuan Hong, Lin Wang, Yan Liu, Jian Zhang, Ke Li
Yong-Hua Wang, Department of Gastroenterology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
Jun Cheng, Yuan Hong, Lin Wang, Yan Liu, Jian Zhang, Ke Li, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, Chinese PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China
Supported by: Grants from the National Natural Scientific Foundation, No. C03011402, No. C30070689, No. C39970674, No. C30371288; and the 9.5 Research and Technique Foundation of PLA, No. 98D063; and the Launching Foundation for Student Studying Abroad of PLA, No. 98H038; and the 10.5 Youth Research and Technique Foundation of PLA, No. 01Q138; and the 10.5 Research and Technique Foundation of PLA, No. 01MB135.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: November 13, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 16, 2003
Published online: April 15, 2004

AIM: To explore the therapeutic effects of recombinant human augmenter of liver regeneration (ALR) on CCl4 liver damage of mice.

METHODS: The recombinant human ALR was prepared by standard procedure of fermentation and chromatography techniques. Chemical liver damage model of mice was established by CCl4. The mice were divided into two groups: group one was treated by recombinant ALR, 2 mg/kg or 20 g, 1/12 h, 4 times, and group two was treated by normal saline as control. After treatment, the mice were sacrificed for collecting the blood sample. For evaluation of chemical liver damage, the serum ALT and AST levels were determined by an autobiochemical processor.

RESULTS: The CCl4 liver damage model was established. After the treatment with recombinant human ALR, the ALT and AST levels in treated groups were significantly decreased as compared with the group treated with normal saline (ALT: 991 U/L vs 2134 U/L, P < 0.01; AST: 938 U/L vs 1873 U/L, P < 0.01), indicating the potent therapeutic effects of recombinant human ALR on mice model of chemical damage caused by CCl4.

CONCLUSION: Recombinant human ALR is successfully prepared and effective in the treatment of murine CCl4 liver damage.

Key Words: N/A
0 引言

肝脏疾病在我国常见[1-10], 如各类病毒性肝炎[8-12]、肝硬化[13-14]. 而肝病的一个普遍的现象就是肝细胞的损害, 因此, 各种肝脏疾病的治疗, 除了病因治疗之外, 促进肝细胞的再生和修复是一项重要的课题和治疗目标. 我们利用大肠杆菌表达重组人肝再生增强因子药物蛋白, 探索促进肝细胞再生和修复的新型药物和新型治疗方法.

1 材料和方法
1.1 材料

应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增人ALR的cDNA基因片段, 克隆到E.coli表达载体pBV220中, 转化E.coli JM109, 制备工程菌. 发酵后, 分离纯化包涵体, 经过包涵体的变性和复性, 然后利用阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛等技术, 纯化重组人肝再生增强因子, 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测显示, 制备的重组人肝再生增强因子纯度在98%以上. 具有促进肝细胞再生的生物学活性.

1.2 方法

取质量大约25 g的Baclb/c小鼠25只. 5只小鼠ip生理盐水作为对照组.小鼠模型20只, 100 mL/L%的CCl4, 10 mL/kg, ip制备模型. 造模4 h后随即分成4组开始治疗试验. 生理盐水组应用生理盐水治疗; 促肝细胞生长素组应用促肝细胞生长素200 mg/kg ip, 1次/12 h, 共4次; 治疗组I应用重组人肝再生增强因子蛋白2 mg/kg, ip, 1次/12 h, 共4次; 治疗组II应用重组人肝再生增强因子蛋白20 g/kg, ip, 1次/12 h, 共4次. 完成治疗后24 h处死动物取血. 治疗完成后, 处死动物, 留取血清标本, 统一用全自动生化仪对于血清中的ALT, AST水平进行检测.

2 结果

通过发酵、细菌包涵体的变性和复性、蛋白质纯化步骤, 获得了重组人肝再生增强因子药物, PAGE检测结果表明, 制备的重组人肝再生增强因子蛋白纯度在98%以上. 应用Cl4后小鼠出现明显的肝脏损伤, 表现在血清转氨酶ALT, AST水平都显著上升. 正常对照组(n = 5)血清中的ALT和AST水平分别为26 U/L和78 U/L. 但中毒后72 h分别上升为2 134和1 873 U/L. 造模前, ALT和AST水平分别为26 U/L和78 U/L. 造模4 h之后, 应用生理盐水治疗组ALT和AST水平分别为2 134 U/L和1 873 U/L, 应用促肝细胞生长素(200 mg/kg)治疗组ALT和AST水平分别为1 172 U/L和1 098 U/L, 重组人肝再生增强因子治疗组I (2 mg/kg)ALT和AST水平分别为1 243 U/L和1 342 U/L, 重组人肝再生增强因子治疗组II (20 g/kg)ALT和AST水平分别为991 U/L和938 U/L (P<0.01, P<0.01), 说明2种剂量的重组人肝再生增强因子对于小鼠化学肝损伤都有显著的治疗作用.

3 讨论

肝脏具有强大的再生能力, 关于ALR作用的机制研究, 关键环节就是ALR结合的特异性的受体. ALR受体蛋白75 Mr. ALR受体不仅仅分布在细胞膜上, 而且在细胞器的膜结构上也有.

肝再生增强因子促进肝再生的机制研究也取得了显著的进展. 目前认为, 肝再生增强因子促进肝再生的作用机制可能与干扰素的调节有关. 外源性ALR可以通过诱导转录因子和翻译相关因子的表达调节线粒体的功能, 或者通过抑制NK细胞的细胞毒性. Polimeno et al[17]的研究结果表明, ALR对于干扰素(IFN)基因表达的影响. IFN由激活的NK细胞所产生, 对于线粒体转录因子A的表达具有显著的调控作用. 外源性ALR对于NK细胞IFN的表达具有显著的下调作用, 70%肝切除动物模型如果施以外源性IFN, 则可以抑制线粒体转录因子A的表达活性, 同时抑制肝再生的过程. 这一结果表明ALR是通过生长因子和免疫因子调节的双重调节机制, 影响肝再生的过程. 研究结果表明, 肝脏中的NK细胞对再生的肝细胞的细胞毒作用可能是爆发性肝炎不能进行有效的肝再生的重要机制. ALR就是通过抑制肝脏内NK细胞的细胞毒活性, 来实现促进肝再生的. 对于各种类型的急性肝脏疾病肝脏的ALR mRNA、血清中ALR蛋白以及外周血NK细胞毒活性进行检测, 以阐明肝再生不力与肝内NK细胞活性之间的关系. 结果表明, 肝脏内ALR mRNA的表达水平显著提高, 血清中ALR水平与肝内ALR mRNA表达水平呈正相关. 在急性肝损伤期, 血清中ALR水平与NK细胞活性呈显著负相关的关系. ALR由肝脏产生, 在肝脏损伤时释放. 研究结果表明, 肝脏产生的ALR通过抑制肝内NK细胞的细胞毒活性, 促进肝再生[18-24].

肝脏疾病的病因是多种多样的, 发病机制各不相同, 因此应该根据病因进行针对性的治疗. 这是目前肝脏疾病治疗的根本原则. 但是, 在目前针对病因学治疗效果欠佳的情况下, 针对各种肝脏疾病都有不同程度的肝细胞损伤的实际情况, 考虑促进肝细胞损伤的修复和肝细胞的再生也是目前不可或缺的补充治疗手段. 相信随着重组人肝再生增强因子的制备成功, 对于各种肝脏疾病的治疗有进入到一个崭新的阶段.

编辑: N/A

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