病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-04-15; 12(4): 828-831
在线出版日期: 2004-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i4.828
应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因
李强, 梁耀东, 成军, 王琳, 张建, 邵清, 刘敏, 程明亮
李强, 梁耀东, 成军, 王琳, 张建, 邵清, 刘敏, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
程明亮, 贵阳医学院第一附属医院感染科 贵州省贵阳市 550004
李强, 男, 生于1969-09-10, 四川泸州市人, 硕士研究生, 主治医师, 主要从事肝病的基础及临床研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, No. C39970674, No. C39900130; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15

目的: 我们在以往的研究中, 应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因. 为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能, 应用酵母双杂交技术, 筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因, 进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径.

方法: 用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因, 连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基和X--半乳糖(X--gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序, 进行生物信息学分析.

结果: 成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达, 配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长, 又能在铺有X--gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个, 其中含人类免疫球蛋白轻链13个, 核小体表面蛋白10个, 铁蛋白重链2个, 人类重组免疫球蛋白λ轻链11个, 14-3-3家族蛋白1个, 脑膜炎球菌PorA蛋白1个, RNA多聚酶III 3个, 烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1个, 细胞色素 P450Ⅱ 2个, SLIT2蛋白1个, DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个.

结论: 成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白, 为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.

关键词: N/A
引文著录: 李强, 梁耀东, 成军, 王琳, 张建, 邵清, 刘敏, 程明亮. 应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(4): 828-831
Screening and cloning of genes coding for leukocyte proteins interacting with NS5ATP9 by yeast-two hybrid technique
Qiang Li, Yao-Dong Liang, Jun Cheng, Lin Wang, Jian Zhang, Qing Shao, Ming Liu, Ming-Liang Cheng
Qiang Li, Yao-Dong Liang, Jun Cheng, Lin Wang, Jian Zhang, Qing Shao, Ming Liu, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Ming-Liang Cheng, The First Affiliated Hospital, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by: Grants from the National Natural Scientific Foundation, No. C03011402, No. C30070689, No. C39970674, No. C39900130; and the 9.5 Research and Technique Foundation of PLA, No. 98D063; and the Launching Foundation for Student Studying Abroad of PLA, No. 98H038; and the 10.5 Youth Research and Technique Foundation of PLA, No. 01Q138; and the 10.5 Research and Technique Foundation of PLA, No. 01MB135.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: November 13, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 16, 2003
Published online: April 15, 2004

AIM: To investigate the biological functions of NS5ATP9, and to screen proteins in leukocytes interacting NS5ATP9 protein by yeast-two hybrid.

METHODS: The NS5ATP9 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and NS5ATP9 bait plasmid was constructed by using yeast-two hybrid system 3, and the yeast AH109 was then transformed. The transformed yeast mated with yeast Y187 containing leukocytes cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) and synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X--gal for selecting two times and screening. After extracting and sequencing of plasmid DNA from blue colonies, we underwent analysis by bioinformatics.

RESULTS: Forty six colonies were sequenced, among which thirteen colonies were Homo sapiens immunoglobulin light chain, ten ubiquitin, two ferritin heavy chain, eleven Homo sapiens rearranged immunoglobulin lambda light chain, one 14-3-3 family protein, one Meningococcus PorA protein, three RNA polymerase III, one tobacco mitogen activated protein kinase, two cytochrome P450 II, one SLIT2 protein, and one dependent-protein kinase catalylic subunit.

CONCLUSION: Genes of NS5ATP9 interacting proteins in leukocytes are successfully cloned and the results bring some new clues for studying the biological functions of NS5ATP9 and associated proteins.

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)严重危害人们的身体健康, 全世界慢性感染的人数超过1.7亿[1]. 感染HCV后, 引起急慢性肝炎、肝脂肪变、肝纤维化甚至发展成为肝细胞癌. 而对于慢性丙型肝炎的治疗, 目前主要用干扰素和利巴韦林抗病毒治疗, 但其疗效有限, 仅仅达20%-40%. 大量的研究表明, 作为HCV非结构蛋白5A (HCV NS5A)是干扰素作用的靶位, 是否也可能是其他抗病毒药物的靶位, 这就有必要对他的功能作深入的研究.

我们实验室应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics), 筛选出HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9, 在GenBank中注册, 注册号为AF529370. NS5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt), 编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成. 我们已经应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)对于NS5ATP9反式调节基因进行筛选, 成功筛选出反式调节作用的靶基因, 为了进一步从不同的角度研究NS5ATP9的作用, 我们又运用酵母双杂交技术筛选NS5ATP9蛋白结合蛋白基因, 对这种基因的功能进行初步研究.

1 材料和方法
1.1 材料

pGBKT7-BD克隆载体、pGADT7-AD克隆载体、pGBKT7-53对照质粒、pGBKT7-Lam对照质粒, Saccharomyces cerevisiae AH109酵母株、Y187酵母株(K1612-1)、预转化入酵母的对照质粒pGBKT7-53(AH109)、编码DNA-BD/鼠p53融合蛋白、pTD1-1(Y187)、质粒pACT2中编码AD/SV40大T抗原融合蛋白、以及预转化的cDNA白细胞文库(Y187)、质粒pACT2表达AD/cDNA文库融合蛋白(PT3183-1), 以上产品均购自Clontech公司. 酵母YPDA培养基、SD/-Trp培养基SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade, X--半乳糖苷酶(Gal)等购自Clontech公司, NcoⅠ、BamHⅠ、半硫酸腺苷、醋酸锂购自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1 诱饵质粒的构建及表达: PCR扩增NS5ATP9基因, 凝胶电泳、回收、连接到T载体、酶切、测序符合率达100%, 与pGBKT7载体连接, 用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后, 表明酵母表达载体pGBKT7-NS5ATP9构建成功, 用醋酸锂法转入酵母细胞AH109后, 在四缺培养基上培养以排除其自身激活作用[2-3].

1.2.2 诱饵与白细胞文库的酵母配合: 挑取在SD/-Trp选择培养基上生长转化子(计数大于1×109细胞/mL)与白细胞文库混合, 30 ℃轻摇配合过夜, 24 h后铺板SD/- Trp/-Leu/-His 25块、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 25块. 同时进行阳性对照实验及文库滴定. 生长18 d后把长出的大于3 mm的酵母集落, 在铺有 X--半乳糖苷酶的QDO上检查-半乳糖苷酶活性, 认为在QDO培养基上生长且出现蓝色菌落的配合为阳性集落.

1.2.3 阳性质粒的克隆和分析: 挑取真正的阳性集落按照试剂盒提供的操作指南Lyticase法提取酵母质粒. 提取的质粒以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠杆菌, 于含有氨苄青霉素的SOB平板培养, 所获得的菌落酶切鉴定后测序. 阳性克隆DNA测序后, 提交GenBank分析, 所获基因都能在GenBank数据库中找到同源基因.

2 结果
2.1 部分筛选克隆BglⅡ酶切鉴定结果

pACT2内含有两个BglⅡ酶切位点, 分别位于多克隆位点两侧, 使用该内切酶消化将释放出白细胞文库的基因片段(图1).

图1
图1 酵母双杂交技术筛选的部分克隆的Bgl Ⅱ酶切鉴定.
2.2 cDNA测序与同源性分析初步结果

配合后筛选出既能在4chongquexian重缺陷(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)培养基又能在铺有X--gal 的4缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落46个克隆测序, 与GenBank数据库进行初步比较. 46个均与已知基因的部分序列高度同源(98%-100%), 详细结果见表1.

表1 诱饵与白细胞文库酵母菌株配合结果.
序号筛选出目的基因同源性相同克隆数
1人类免疫球蛋白轻链99%13
2核小体表面蛋白98%-100%10
3铁蛋白重链198%-99%2
4人类重组免疫球蛋白λ轻链98%-99%11
514-3-3家族蛋白100%1
6脑膜炎球菌PorA蛋白99%1
7RNA多聚酶III99%3
8烟草有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶100%1
9细胞色素 P450Ⅱ99%2
10SLIT2蛋白99%1
11DNA依赖蛋白激酶催化亚基98%1
3 讨论

丙型肝炎病毒基因编码10种蛋白, 包括结构蛋白和非结构蛋白. 非结构蛋白NS5A与丙型肝炎的致病有关, 而丙型肝炎的致病机制可能与病毒蛋白对肝细胞或白细胞的作用有关. 非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)是NS5A的反式激活新型靶基因编码的蛋白, 研究他的功能对理解NS5A蛋白的作用具有重要意义. 因此, 我们利用1990年代初出现的酵母双杂交技术, 进行了白细胞文库的筛选, 希望筛选出与病毒蛋白相互作用的蛋白基因. 酵母双杂交系统是分析真核细胞中蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用的一种有效的基因分析方法, 他的产生为研究蛋白在体内生理情况下的相互作用提供了一种新的遗传学方法. 酵母双杂交系统通过将两个推定有相互作用的蛋白X和Y分别融合到一酵母转录激活因子的BD和AD上, X与Y的相互作用重构了激活因子, 从而导致下游"报告基因"的转录, 产生容易探测到的表型[4-8].

我们在真核表达载体pGBK-T7中构建pGBKT7-NS5ATP9诱饵质粒并在酵母菌株AH109中表达了NS5ATP9 基因, 与人白细胞cDNA文库的酵母菌株Y187进行配合, 筛选出与之相互作用的蛋白基因11种. 其中, 有基因编码的蛋白属于14-3-3家族的蛋白, 通过结合磷酸丝氨酸, 遏制蛋白介导信号转导, 他普遍存在与动、植物中, 编码的蛋白与RAF1和CD25磷酸酶相互作用, 在连接有丝分裂信号和细胞周期中起重要作用[9-17]. 脑膜炎球菌PorA蛋白用作疫苗是很有前途的, 虽然已经搞清楚这个蛋白的结构, 但是对他的结构与PorA蛋白抗体的关系还知知甚少, 研究发现可能主要与效应器功能活动和可变区基因序列有关[18]. 由RNA多聚酶III引起转录包含多聚酶的复原, 启动, 延伸, 终止的步骤. 多聚酶III由16个亚单位组成, 一部分受HeLa细胞修饰, 能分解成hRPC32、hRPC39、hRPC62亚复合物, 但他的核心缺乏亚复合物, 不能与附属因子连接而使启动子依赖的转录起动. 特有的转录启动能力需要自然亚复合物恢复. 亚单位的一部分与RNA多聚酶 III转录起始因子的两个亚复合物(hTBP/hTFIIIB90)相互作用. 这些说明hRPC32-hRPC39-hRPC62亚复合物经TFIIIB、hRPC39相互作用指导RNA多聚酶III结合到FIIIB-DNA复合物[19-21], 提示NS5ATP9可能与转录有关. 烟草有丝分裂原激活蛋白激酶在细胞的分裂中起重要作用, 而NS5ATP9能与他相互作用, 提示他可能与肝细胞的分化有关[22]. SLIT2是一种分泌型的富含亮氨酸重复区的蛋白质, 有明确的肿瘤抑制作用, SLIT2转染COS-7细胞的培养液能延缓细胞的生长和诱导SW48结肠癌细胞凋亡, SLIT2的过表达可以抑制70%的体外培养乳腺癌细胞的集落化生长, 在发生肺癌及乳腺癌时, 由于其启动子的甲基化或等位基因的丢失而导致其失活[23-26]. 铁蛋白是主要铁储存蛋白, 由两部分亚基(重链和轻链)构成. 基因分析显示他由多基因家族或者多个外显子编码. 细胞内铁蛋白的生物合成受铁的调节, 他是翻译调节的顺式元件, 在铁蛋白重链5'-非翻译前导区. 鼠纤维母细胞瞬时转染体\稳定转化体能激活人铁蛋白重链mRNA的转录. mRNA翻译是基因表达调控的重要机制, 不同亚单位说明铁吸收、存储、释放的不同. 铁蛋白重链使细胞内铁分离, 刺激铁调节蛋白2的表达, c-myc抑制了他的表达而使铁库储存铁增加. 这就调控细胞内铁的浓度, 对细胞增生调控起重要作用[27-36].

通过以上结果提供的这些线索, 我们可以进行更深入的研究, 进一步弄清各种蛋白对NS5ATP9生物学功能的影响及其确切的作用, 为寻找与HCVNS5A的靶位相互作用的蛋白开辟新道路. 当然, 这些结合蛋白的发现只是研究病毒蛋白功能的一个起点, 在极其复杂的体内环境中, 需要更多的实验证据来揭示这种结合的生物学意义.

编辑: N/A

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