基因表达谱芯片技术筛选肝再生增强因子反式调节基因

摘要

目的: 为了阐明人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR)的表达对于肝细胞基因表达谱的影响, 我们应用基因芯片技术, 对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.

方法: 从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)扩增出ALR编码区DNA, 常规分子生物学技术构建ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ALR, 利用脂质体转染技术转染HepG2细胞, ALR的表达以 Western blot杂交技术证实. 从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 并进行基因芯片技术分析.

结果: 经过限制性内切酶分析和序列测定, 证实pcDNA3.1(-)-ALR构建正确. ALR在HepG2细胞中的表达以Western blot杂交技术得到证实. 对于ALR重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱, 利用基因芯片技术进行分析. 结果表明, 2种基因的表达水平上调, 24种基因的表达水平下调. 这些基因包括淀粉酶、肿瘤坏死因子受体、金属蛋白酶1组织抑制因子、性激素相关蛋白等基因, 相信这些类型的基因在ALR所发挥的生物学效应起到重要的作用.

结论: ALR对于肝细胞基因表达谱存在一定影响; 基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径, 有助于了解ALR对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.

关键词: N/A

Screening and identification of genes transactivated by human augmenter of liver regeneration by microarray assay

Lin Wang, Ke Li, Jun Cheng, Jian Zhang, Qing Shao, Min Liu

Lin Wang, Ke Li, Jun Cheng, Jian Zhang, Qing Shao, Min Liu, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, the 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China

Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn

Received: November 13, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 16, 2003
Published online: April 15, 2004

Abstract

AIM: Augmenter of liver regeneration (ALR) is a protein that plays a role in liver regeneration. In order to clarify the effect of the expression of ALR on profile of the hepatocytic gene expression, we analyzed difference between the HepG2 cells transfected with ALR and controls by using gene chip technology.

METHODS: Total RNA was extracted from HepG2 cells,and RT-PCR was performed to amplify the coding region of ALR. The expression of ALR in the transfected HepG2 cells was confirmed by Western blot. Total mRNA was isolated from the transfected HepG2 cells with pcDNA3.1(-) and pcDNA3-ALR, respectively. cDNA was prepared by reverse transcription. Microarray assay was conducted for screening of up-and down-regulated genes in both HepG2 cells.

RESULTS: The expressive vector of pcDNA3(-)-ALR was constructed and confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The expression of ALR was confirmed by Western blot. After screening with cDNA microarray, we found 2 genes were up-regulated, and 24 genes including TNFRSF1A-associated via death domain, tissue inhibitor of metalloproteinase 1, epididymal androgen-related protein, down-regulated.

CONCLUSION: ALR is a cell growth factor, which has some influences on gene expression profile of hepatocytes; Microarray technology is a method to analyze gene expression spectra of trans-regulation of a protein and conducive to understand the regulative effect of ALR on hepatocytes and other biological function.

Key Words: N/A

0 引言

肝脏是为数不多能够再生的哺乳动物器官, 生长因子在肝再生启动及其进程中发挥着举足轻重的作用[1-7]. 肝再生增强因子(augmentor of liver regeneration, ALR)或称肝细胞生成素(hepatopoietin, HPO), 是一种刺激肝细胞增生的小分子物质, 组织分布广泛, 缺乏特异性, 但并不排除其作用靶位是特异的. 除了主要的促进肝再生活性外, ALR还参与核及线粒体转录文本的合成、稳定, 及一些重要脏器(如生殖细胞)的发育过程. 我们曾经利用酵母双杂交方法发现了一些与ALR具有结合作用的蛋白质[8-11], 现应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)对于ALR反式调节的靶基因进行了筛选, 从另一角度探讨ALR潜在的生物学功能.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2细胞及感受态E.coli JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); Lipofectamine PLUS 转染试剂(Gibco), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega). 真核表达载体及细胞转染ALR蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-ALR为本室构建[25]. 用Lipofectamine PLUS 转染试剂将2 g pcDNA3.1(-)-ALR及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2 细胞, 48 h后收获细胞.

1.2 方法

细胞mRNA提取使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了ALR表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性定量分析. 参照Schena et al的方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA (5 g), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 g). 乙醇沉淀后溶解在5×SSC+2 g/L SDS 20 L杂交液中. 包含1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/l溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用2 g/L SDS、水及2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.将基因芯片和杂交探针在95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+ 2 g/L SDS、1 g/L×SSC +2 g/L SDS、1 g/L×SSC洗涤10 min, 室温晾干.用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3小于0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱[12-19].

2 结果

真核表达质粒pcDNA3.1(-)-ALR由本室构建. 总RNA的吸光度A260/A280>1.89, 热稳定实验70 ℃保温1 h与 -20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.

2.1 ALR上调基因两条.

ALR上调基因两条如表1.

表1 部分表达显著增加的基因.

GenBank号	编码蛋白	Cy5/Cy3
NM_000699	淀粉酶2A(AMY2A)	2.053
NM_016045	推测蛋白(CGI-107 protein, LOC51012)	2.056

2.2 ALR下调基因

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为HCV NS3蛋白得下调基因. 结果有24种基因的表达水平下调(表2).

表2 部分表达显著下降的基因.

GenBank登陆号	编码蛋白	Cy5/Cy3
NM_001509	谷光甘肽过氧化物酶5转录变体1(附睾雄激素相关蛋白)(GPX5)	0.183
NM_002388	小染色体维持缺陷3(MCM3)	0.287
NM_021016	妊娠特异β1糖蛋白3(PSG3)	0.302
NM_003254	金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)	0.341
NM_004728	天冬-谷-丙-天冬/组氨酸多肽21盒(DDX21)	0.351
NM_003998	NFB1	0.367
NM_003330	硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)	0.369
NM_001554	富含半胱氨酸的血管生成诱导物61(CYR61)	0.370
NM_002820	甲状旁腺激素样激素(PTHLH)	0.374
NM_003789	肿瘤坏死因子受体超家族1A死亡域转录变异体1 (TRADD)	0.376
NM_003564	(transgelin 2, TAGLN2)	0.380
NM_005573	核纤层蛋白B1 (LMNB1)	0.383
NM_005053	酿酒酵母RAD23同源物 (RAD23A)	0.405
NM_007002	细胞膜糖蛋白Mr 110 000 (GP110)	0.428
NM_005770	small EDRK-rich factor 2, (SERF2)	0.441
NM_001823	脑肌酸激酶(CKB)	0.449
NM_001343	disabled (Drosophila) homolog 2(mitogen-responsive phosphoprotein) (DAB2)	0.453
NM_014889	金属蛋白酶(MP1)	0.454
NM_002782	妊娠特异1糖蛋白6(PSG6)	0.454
NM_003752	真核转录起始因子3亚单位8 (EIF3S8)	0.455
NM_005160	肾上腺受体激酶2(ADRBK2)	0.473
NM_003682	MAPK激活死亡域(MADD)	0.476
NM_000048	精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)	0.483
NM_005950	金属硫蛋白1G(MT1G)	0.491

3 讨论

肝炎、肝硬化在我国发病率高、危害严重, 预防肝坏死与促进肝再生已成为目前临床肝损伤各种治疗的出发点. ALR是一种能够特异作用肝细胞或肝癌细胞细胞因子, 具有明确救治功能和药用价值. 他促使肝细胞从G1期向S期过渡, 有助于肝再生的完成[20-30]. ALR调控肝再生的作用机制是研究是问题的关键, 但还不能取得一致.

我们利用基因芯片技术对ALR上调、下调基因进行分析, 结果表明24种基因的表达水平下调, 包括肿瘤坏死因子受体、金属蛋白酶1组织抑制因子、激素相关蛋白等基因. 肿瘤坏死因子受体胞质内保守的死亡域(TRADD)是触发细胞凋亡通路的必要的成分, MADD被鉴定为TNFR1信号复合物含死亡域蛋白家族成员, 他们在TNF起始的不同信号级联反应中起到中枢调节作用, 资料显示MADD可激活丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)的ERK及JNK途径并使胞质内磷脂酶A2的磷酸化进而导致花生四烯酸的释放, 除了介导炎症的发生还参与TNF诱导的凋亡. ALR对这两种基因均有一定的下调, 可能的解释是在肝再生过程中对细胞凋亡产生部分抑制作用, 新增肝脏组织以自分泌形式分泌生长因子为其他细胞的再生提供丝裂源和死亡信号的抑制分子. ALR下调的另一种感兴趣蛋白是金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1), TIMP是参与细胞外基质降解代谢的基质金属蛋白酶(MMP)特异性抑制物, 可以抑制所有MMP的活性, 在肝纤维化的发生发展中起重要作用. 我国学者认为TIMP1可特异性地结合激活间质胶原酶从而抑制其对胶原蛋白的分解, 促进肝纤维化形成, 而重组ALR有减轻实验性肝纤维化形成的作用. TIMP1表达的上调或下调的效应方向依赖于细胞背景, 我们发现ALR在人肝癌细胞(HepG2)中下调TIMP1基因的表达, 这种活性对于有序的肝再生和抗肝纤维化治疗是十分有利的. 此作用被另一组实验所证实, 王爱民et al观察到大剂量ALR对TIMP1基因的表达有明显的抑制作用. 实验结果发现ALR下调了一些性激素相关蛋白, 如谷光甘肽过氧化物酶5, 该蛋白可保护精子细胞膜免受脂质过氧化的损害, ALR能够显著下调其基因的表达, 可能与ALR在调节生殖细胞发育过程中有关系, 但是具体作用不明. 此外, ALR下调一些核酸与蛋白的翻译与修饰功能相关蛋白: 天冬-谷-丙-天冬/组氨酸多肽21盒、真核转录起始因子3亚单位8、NFB1等. 受ALR上调的蛋白很少, 其中包括一个未知功能基因, 我们正对其进行克隆, 并将在真核细胞内证实这种上调作用.

备注

编辑: N/A

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