病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-04-15; 12(4): 809-812
在线出版日期: 2004-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i4.809
HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响
成军, 李克, 刘妍, 王琳, 陆荫英, 钟彦伟
成军, 李克, 刘妍, 王琳, 陆荫英, 钟彦伟, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
成军, 男, 1963-08-17生, 山东省淄博市人, 汉族. 1994年北京医科大学传染病学博士, 1994-11-17/1997-12-01美国得克萨斯大学健康科学中心临床免疫与传染病科完成博士后研究. 主要学术研究方向是肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学机制, 出版专著5部, 发表论文及综述400篇. 现任中华医学会传染病与寄生虫病学分会副主任委员、中华医学会热带病与寄生虫病学分会常委、解放军医学会传染病专业委员会委员, 中华传染病杂志》副主编、《胃肠病学和肝病学杂志》副主编、《热带病与寄生虫病杂志》副主编, 《中华肝脏病杂志》、《World J Gastroenterol》编委等.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, No. C39970674; 军队九、五科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队十、五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队十、五科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15

目的: 研究HCBP6蛋白在细胞内表达时, 是否通过蛋白-蛋白之间的相互作用, 对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响.

方法: 利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体. 酶联免疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测CAT的表达水平, 间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性.

结果: 重组表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)-core 经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误. 转染HepG2细胞之后, HCV核心蛋白的表达, 对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显著的反式激活作用. 但是, 当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时, SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制. 重复试验得到了相似的结果. HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4%-62.3%.

结论: HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显著的抑制作用.

关键词: N/A

引文著录: 成军, 李克, 刘妍, 王琳, 陆荫英, 钟彦伟. HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(4): 809-812
Effects of HCBP6 protein on transact-ivating function of HCV core protein
Jun Cheng, Ke Li, Yan Liu, Lin Wang, Yin-Ying Lu, Yan-Wei Zhong
Jun Cheng, Ke Li, Yan Liu, Lin Wang, Yin-Ying Lu, Yan-Wei Zhong, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, Chinese PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China
Supported by: National Natural Science Foundation No. C03011402,No. C30070689,No. C39970674. and Returned Scholarship of General Logistics Department of Chinese PLA of China.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: November 13, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 16, 2003
Published online: April 15, 2004

AIM: To study the inhibitory effects of HCBP6 on the transactivating effect of HCV core protein.

METHODS: The recombinant vectors expressive HCV core protein and HCBP6 protein were constructed, respectively, by routine molecular techniques. The hepatoblastoma cell line HepG2 were co-transfected. The chloramphenicol transferase (CAT) expressive levels under the SV40 early promoter were determined by an enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA) kit.

RESULTS: The recombinant vectors of pcDNA3.1(-)-HCBP6 and pcDNA3.1(-)-core were constructed, and demonstrated correctly by restriction enzyme digestion and sequencing analysis. The hepatoblastoma cell line HepG2 was transfected with the vector alone or combined, respectively. The expression level of CAT indicated that the inhibitory rate was 40.4%-62.3%.

CONCLUSION: The expression of HCBP6 has inhibitory effects on the transacting activity of HCV core protein.

Key Words: N/A


0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)是我们应用酵母双杂交(yeast-two hybrid)技术从肝细胞cDNA文库中筛选得到的一种与HCV核心蛋白能够结合的未知功能基因[1-2]. 他位于人22号染色体上的不含有内含子(intron)的基因. HCBP6蛋白也可能分布在细胞核膜的胞质侧, 其生物学功能与生物大分子细胞质/核之间的主动运输过程有关[3-6]. HCBP6蛋白能够上调和下调一系列不同基因的表达水平[7]. HCBP6蛋白对于新生多肽相关复合体亚单位(NACA)的基因表达具有显著的上调作用, 提高4.75倍. HCBP6蛋白的表达的确对于NACA的启动子转录活性具有显著的上调作用[8]. 因此, 认为HCV的核心蛋白可能通过与HCBP6蛋白之间的结合, 干扰细胞内正常的新生多肽的转运过程[9-12]. 另外, HCV核心蛋白与HCBP6蛋白之间的结合, 对于HCV核心蛋白的生物学活性也应该具有显著的影响, 但是目前还缺乏这方面的研究资料.我们利用细胞共转染技术, 证实HCBP6蛋白在细胞内的表达, 可以抑制HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性.

1 材料和方法
1.1 材料

pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen公司)、SV40病毒即刻早期启动子指导的CAT的报告基因表达载体pCAT3载体购自Promega公司, 脂质体FuGENE6购自Roche公司, Taq DNA 聚合酶购自鼎国生物公司, 限制性内切酶购自Takara公司. 质粒DNA提取试剂盒(Promega公司), 玻璃奶DNA回收试剂盒(博大公司), CAT ELISA试剂盒(Roche公司). 引物合成、核苷酸序列测序由上海博亚公司完成. E. coli DH5, 肝母细胞瘤细胞系HepG2为本室保存. pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)-core构建和鉴定见文献[7,13-15].

1.2 方法

HepG2细胞系在含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液中生长. 细胞生长至50%-80%融合度时采用脂质体转染法, 具体转染方法参照FuGENE6说明书进行, 质粒转染48 h后收获细胞进行裂解, 提取上清液, 取200 L用于检测CAT的表达量. 具体方法严格按照CAT ELISA试剂盒说明书进行, 在415 nm光波下测吸光度A值[16-20].

2 结果

利用重组表达载体的限制性内切酶作图分析和插入片段的核苷酸序列分析, 证实构建的pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)-core表达载体正确[7-13]. 由2人分别进行共转染实验. 第一批实验中, 发现HCV核心蛋白的表达对SV40即刻早期启动子的转录活性具有显著的反式激活作用. 当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时, 对于HCV核心蛋白的反式激活作用具有显著的抑制作用, 抑制率为62.3%(图1). 第2批实验中, 结果类似. HCV核心蛋白反式激活SV40即刻早期启动子的转录活性达到4.7倍, 当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时, 对于HCV核心蛋白的反式激活作用具有显著的抑制作用, 抑制率为40.4%(表1, 图2).

表1 pCAT3 + pcDNA3.1(-)-core和pcDNA3.1(-)-Hcbp6共转染实验.
分组报告质粒转染质粒CAT酶A相对倍数
1pCAT3-promoterpCAT3-basic0.3451.0
2pCAT3-promoterpcDNA3.1(-)0.3951.0
3pCAT3-promoterpcDNA3.1(-)-core1.6294.7
4pCAT3-promoterpcDNA3.1(-)HCBP60.4021.0
5pCAT3-promoterpcDNA3.1(-)-core
pcDNA3.1(-)HCBP60.9882.8
图1
图1 HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响. 1: pCAT3; 2: pCAT3 + pcDNA3.1(-)-Hcbp6; 3: pCAT3 + pcDNA3.1(-)-core; 4: pCAT3 + pcDNA3.1(-)-core; 5: pCAT3 + pcDNA3.1(-)-core +pcDNA3.1(-)-Hcbp6; 6: pCAT3 + pcDNA3.1(-)-core + pcDNA3.1(-)-Hcbp6.
图2
图2 肝母细胞瘤细胞系HepG2的共转染实验. 1: 对照 pCAT3-basic; 2: 空白 pcDNA3.1-; 3: HCV 核心; 4: HCBP6; 5: HCV 核心+HCBP6.
3 讨论

肝炎病毒蛋白的表达, 对于肝细胞的基因表达谱具有显著的影响[21-26]. 有些病毒蛋白具有细胞核内定位信号, 通过不同的磷酸化修饰, 发生细胞质到细胞核的转位, 在细胞核内发挥其反式激活作用, 这种细胞核内的反式激活作用, 或者通过直接与肝细胞基因组DNA序列中的启动子结构结合, 发挥转录调节作用; 或者通过与细胞核内的相关的转录因子蛋白之间的结合, 间接影响肝细胞基因组的转录表达[27-49]. 但是, 肝炎病毒蛋白的亚细胞定位更为主要的是在细胞质中分布, 通过复杂的多环节的信号转导通路, 间接对肝细胞基因组的转录表达发挥反式调节作用. 肝炎病毒蛋白的反式激活经常会有共同的作用对象, 发现一些共同的反式调节靶基因. 2种技术同时发现的反式调节基因类型包括: MHBst调节原癌基因c-myc、HBxAg蛋白反式调节S-100钙结合蛋白A11、HCV NS3蛋白反式调节真核翻译延伸因子2(EEF2)、HCV NS5A蛋白反式调节新基因序列NS3TP6等[36].

利用报告基因的共转染技术, 我们首先证实了HCV核心蛋白的反式激活作用, 同时发现HBV和HCV反式激活作用的蛋白之间还具有显著的协同作用. 我们也曾经利用酵母双杂技术, 对于HCV核心蛋白的肝细胞内的结合蛋白进行筛选, 获得了一个新的未知功能基因, 命名为HCBP6[1,50-61]. 除了酵母双杂交的筛选以及回交试验结果证实HCBP6蛋白与HCV核心蛋白之间具有结合作用之外, 我们还利用经典的免疫共沉淀技术证实了这2种蛋白在体外的相互结合[57]. HCBP6蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的表达, 也提示HCBP6蛋白的亚细胞定位在细胞核膜的胞质侧[3]. 因为HCV核心蛋白具有反式激活作用, 在肝细胞内又能够与HCBP6蛋白结合, 因此, 我们推测HCBP6与HCV核心蛋白的结合, 应对于HCV核心蛋白的反式调节作用具有显著的影响. 本文结果表明存在这样的生物学效应[62-70]. 目前我们正在研究HCV核心蛋白的反式激活作用, 以及HCBP6蛋白的表达对HCV核心蛋白反式激活作用进行抑制的信号转导途径. 相信通过这些研究, 最终阐明HCV核心蛋白在慢性病毒性肝炎、肝纤维化、HCC发生发展中的作用和机制.

编辑: N/A

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