胃癌候选抑癌基因Syk表达的意义

摘要

目的: 探索酪氨酸激酶Syk (spleen tyrosine kinase, Syk)基因的表达与胃癌生成及转移的关系.

方法: 用半定量RT-PCR检测胃癌组织、正常胃组织61例Syk mRNA, p53的表达, 同时用免疫组化方法检测Syk的表达.

结果: 所有正常胃组织都有Syk基因的表达, 而61例胃癌组织中只有14例表达, 正常胃组织Syk基因表达率显著高于胃癌组织(χ² = 72.3, P<0.05), 且胃癌组织中Syk mRNA含量比正常胃组织显著降低(t = 2.1, P<0.05). 31例有淋巴结转移的胃癌组织中, 3例有Syk基因表达, 30例无淋巴结转移的胃癌中有11例检测到Syk mRNA的表达, 有淋巴结转移的胃癌Syk mRNA的表达率和表达水平显著降低(χ² = 4.85, P<0.05), 且Syk mRNA表达与p53的表达呈正相关(χ² = 22.03, P<0.05).

结论: Syk基因的表达缺失与胃癌的生长及转移相关, 呈p53依赖性.

关键词: N/A

Expression of tyrosine kinase Syk and its clinical significance in gastric carcinoma

Jian-Guo Xia, Yong-Bin Ding, Guo-Yu Chen

Jian-Guo Xia, Yong-Bin Ding, Guo-Yu Chen, Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Supported by: the Science Fund of Department of Education of Jiangsu Province, No. B (03KJD320138).

Correspondence to: Jian-Guo Xia, Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. njdyb@sina.com

Received: June 27, 2003
Revised: January 1, 2004
Accepted: March 16, 2004
Published online: April 15, 2004

Abstract

AIM: To evaluate the effects of the Syk mRNA expression in human gastric carcinoma on tumor growth and metastasis, and the correlation of expression of the Syk gene with p53.

METHODS: Using semi-RT-PCR technique, we detected specimens from 61 gastric carcinoma patients (tumor tissues, adjacent normal tissues) for their rate and level of Syk and p53 gene expression. Meanwhile, immunohistochemical staining was also used to detect Syk expression.

RESULTS: All normal gastric tissues were detected the expression of the Syk gene. Unlike normal tissue, 47 out of 61 breast cancer tissue did not show any detectable Syk mRNA expression, and there were significant difference between the two groups (χ² = 72.3, P < 0.05). The level of Syk mRNA in the primary gastric carcinoma tissues was significantly lower than that in the adjacent non-cancerous gastric tissues (t = 2.1, P < 0.05). Furthermore, only 3 gartric carcinoma tissues in 31 patients with lymph node metastasis had the Syk mRNA expression. The Syk mRNA expression was negatively correlated to lymph node metastasis (χ² = 4.85, P < 0.05). And the Syk expression was correlated to that of p53 (χ² = 22.03, P < 0.05).

CONCLUSION: The expression of the Syk gene may play an important role in suppressing growth and metastasis in gastric cancer. Syk gene expression is repressed in a p53-dependent manner.

Key Words: N/A

0 引言

胃癌的发生、发展是一个复杂的多阶段的过程, 包括癌基因的激活和抑癌基因的变异和缺失. 在对胃癌的研究中, 基因的变异对肿瘤的生成和转移一直是焦点[1-2], 在胃癌的信号传导途径中, 酪氨酸激酶起着至关重要的作用. 酪氨酸激酶Syk是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶, 近来的研究表明Syk的表达缺失与恶性肿瘤的发病机制有关, 其被认为能抑制恶性肿瘤的生长和转移. 我们用半定量RT-PCR法检测胃癌中Syk的表达情况, 同时分析患者的发病年龄、肿瘤大小, 病理分级、淋巴结转移的情况, 以探讨Syk的表达与胃癌病理特征的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

我院2002-08/2003-08手术切除的胃癌标本61例, 分别取瘤体及距瘤体5 cm外正常胃组织标本, 迅速经液氮冷冻后置-70 ℃冰箱保存备用. 年龄16-80岁(平均55岁), 男37例, 女24例, 有淋巴结转移31例. 所有肿瘤标本都经病理证实, 总RNA的提取采用Roche公司Trizol RNA提取试剂.

1.2 方法

按说明书过程提取总RNA. RT及PCR在PE-2400型PCR仪上进行. 取总RNA4 L经RNase Free DNase消化可能存在的痕量DNA后, 采用逆转录酶Mu-MLV按20 L体系42 ℃逆转录45 min, 99 ℃ 5 min灭活AMV酶. 取得的cDNA按50 L的体系进行PCR扩增, PCR反应系统如下: 10×Buffer 5 L, MgCl₂ 3 L, dNTP Mix 1 L, 引物1, 2各1 L, Taq酶0.5 L, 模板10 L, 无核酸水 33.5 L. 预变性94 ℃ 5 min, 94 ℃变性45 s, 61 ℃退火1 min, 72 ℃ 延伸45 s, 30个循环后72 ℃延伸7 min. Syk扩增引物正链为: 5'-CATGTCAAGGATAAGAACATCATAGA-3'; 反链为: 5'-AGTTCACCACGTCATAGTAGTAATT-3', 扩增片段为514 bp. 并用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作内对照, GAPDH 引物正链为: 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTGCAGGG-3', 负链为: 5'-GTCACTGGCGTCTTCACCACCATG-3', 扩增片段为143 bp. PCR产物5 L于15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 于紫外分析仪下分析结果. 电泳产物条带用Fluor-S多图像分析, 每一电泳带的强度与GAPDH相对照, 算出每一PCR产物的相对含量. p53扩引物正链为5'-ACGACGGGGCTGGTTGCCCA-3', 反链为5'-CTCCCAGAGACCCCAGTTGC-3', 扩增片段为201 bp, 反应条件为预变性94 ℃ 5 min, 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 min, 72 ℃延伸30 s, 30个循环后72 ℃延伸7 min.

同时用免疫组化检测患者Syk表达情况, 瘤体标本中性甲醛固定, 石蜡包埋, 连续切片, 厚约4 m进行免疫组化检查. 切片脱蜡水化后, PBS(磷酸缓冲液, PH = 7.4)冲洗3次, 3 min/次; 加过氧化物酶阻断溶液50 L, 以阻断内源性过氧化酶活生, 室温下孵育10 min; 切片放入盛有0.01 mol/L PBS溶液中置微波炉中至90 ℃左右, 10 min. PBS冲洗3次, 每次3 min. 每张切片加入100mL/L羊血清50 L, 室温下孵育10 min, PBS冲洗1次. 切片中加入第一单抗(鼠抗人Syk, 1: 25, )50 uL室温下反应2 h; PBS冲洗3次, 3 min/次. 再加入生物素标记的二抗(羊抗鼠IgG, 1: 50)后室温下孵育10 min, PBS冲洗, 加入链球菌抗生素-过氧化物溶液50 uL, 室温下孵育10 min, PBS冲洗, 最后切片上加入新配制的DAB(联苯二胺)溶液100 L, 蒸馏水冲洗, 苏木素染色, 梯度酒精脱水干燥, 中性树胶封闭. Syk为细胞膜着色, 按肿瘤细胞着色强度及阳性细胞的分析范围分为两个等级: 以10%-30%细胞呈弱、中等强度阳性反应为标准, 分为阴性和阳性, 并分析其与患者肿瘤大小、肿瘤分级、淋巴结大小情况.

统计学处理 不同组织中Syk基因的表达强度的比较用t检验. 相关性分析采用χ²统计学分析.

2 结果

2.1 Syk在胃癌组织中的表达

应用RT-PCR法, 正常胃组织61例均能检测出Syk mRNA的表达, 而胃癌标本61例仅14例有Syk mRNA的表达 (χ² = 72.3, P<0.05, 图1). 有淋巴结转移的31例胃癌中, 有3例可检测出Syk mRNA表达, 而无淋巴结转移的30例胃癌组织中11例有Syk mRNA表达(χ² = 4.85, P<0.05). Syk mRNA的表达与年龄、肿瘤分级、大小及浸润深度无关(资料未列出). 应用免疫组化法, 在61例正常胃组织中有56例Syk阳性, 61例胃癌组织中有12例阳性, 两组Syk阳性率差异有显著性(χ² = 61.43, P<0.05). RT-PCR法和免疫组化法检测Syk的阳性率没有显著性差异(χ² = 3.27, P >0.05).

图1 正常胃组织Syk基因PCR产物电泳图.

2.2 半定量RT-PCR

RT-PCR产物10 L用15 g/L的琼脂糖电泳, GAPDH作为对照, 分析不同组织中Syk含量(图1). 胃癌组织中Syk表达水平为1.71±1.23, 邻近正常胃组织中为3.19±0.59, 胃癌组织Syk/GAPDH比邻近组织显著降低(t = 2.1, P<0.05). 有转移的胃癌组织Syk表达水平为1.18±1.13, 无转移的胃癌组织Syk表达水平为2.14±1.27, 有转移的胃癌组织中Syk/GAPDH比无转移者显著降低(t = 3.4, P<0.05).

2.3 p53基因在胃癌组织中的表达

61例胃癌组织中有19例可检测到p53基因, 邻近正常胃组织中有53例有p53基因表达, 胃癌组织中Syk基因表达率显著低于正常胃组织(χ² = 36.91, P<0.05). 31例有淋巴结转移的胃癌组织中p53 mRNA表达阳性4例, 30例无淋巴结转移的胃癌组织中阳性表达15例, 有淋巴结转移p53 mRNA阳性率显著低于无淋巴结组(χ² = 8.13, P<0.05).

2.4 Syk mRNA与p53 mRNA表达的关系

p53表达阳性的19例胃癌瘤体中, 有12例检出Syk mRNA的表达, 42例p53阴性胃癌组织中Syk mRNA的表达2例, p53表达阳性的胃癌组织Syk mRNA的表达检测高于p53表达阴性的胃癌组织(χ² = 22.03, P<0.05).

3 讨论

Syk广泛在造血细胞上表达, 长期以来一直作为信号传导过程中一个影响因子而被广泛研究. 在前后串排和多个自体磷酸化部位含有两个Src同源序列SH2. Syk通过SH2区域与依赖酪氨酸的免疫受体活化基序(ITAM)结合而活化, 并且在淋巴细胞发展及免疫细胞活化过程中起着极为重要的作用, Syk的表达缺失可导致B、T细胞的成熟障碍, 从而使机体失去对突变细胞的监控作用[3].

我们应用RT-PCR及免疫组化法检测Syk在胃癌在的表达情况, 结果发现Syk mRNA在胃正常组织中表达率及表达水平高于胃癌组织, 两组差异有显著性, 这表明Syk mRNA的表达缺失可能与胃癌的发生有关, Sada et al认为Syk是一种候选抑癌基因, Syk的缺失会致免疫细胞发育、成熟障碍, 重者会导致重症联合免疫缺陷病(SCID), 从而使肿瘤易于发生. 同时我们也注意到RT-PCR法检测Syk的阳性率高于免疫组化法, 但两种检测方法差异没有显著性, 这可能与样本量过小有关.

在31例有淋巴结转移的胃癌组织中只有3例检测到Syk mRNA的表达, 有淋巴结转移的胃癌细胞的Syk mRNA的检测率远低于无淋巴结转移组, 这表明Syk mRNA的表达缺失可能与胃癌的淋巴转移有关, 但非受体型酪氨酸激酶Syk的信号传导在肿瘤的转移过程中如何起作用还不清楚. Carter WB认为Syk与HER2/neu一对功能相反的抑癌/癌基因, HER2/neu的过度表达可诱导血管内皮细胞的收缩, 从而使肿瘤细胞易于穿过血管屏障, 易于发生转移, 而Syk可抑制HER2/neu的收缩血管内皮细胞作用, 从而抑制肿瘤的转移[4].Mahabeleshwar研究认为Syk通过抑制PI-3 (phosphatidylinositol 3, PI-3)激酶的活性, 从而抑制肿瘤细胞的分裂和核因子NF -B调节的u-PA(urokinase type plasminogrn, u-PA)的激活分泌, 而过去研究证实u-PA的激活分泌与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移相关[5-6].

在p53表达阳性的胃癌组织中, Syk mRNA的表达率及表达水平较高, 且与p53表达相关, Syk基因的表达呈p53依赖性的, 在肿瘤生成过程中p53的功能丧失会导致Syk的活性下降, 从而使肿瘤易于生成和转移. Syk是内皮细胞生长的重要调控因素, 非受体型蛋白酪氨酸激酶在胃癌的生成、转移过程中的作用尚进一步探索. 现在的初步研究为将来防治胃癌提供了新的分子学靶位, 因而对Syk的进一步深入研究, 必将为胃癌治疗的提供新的策略[7-8].

备注

编辑: N/A

参考文献

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2.	郝 冬梅, 孙 秀菊, 郑 志红, 贺 光, 马 鸣超, 徐 惠绵, 王 梅先, 孙 开来. 胃癌癌前病变相关基因的筛查及表达研究. 世界华人消化杂志. 2003;11:6-9.  [PubMed]  [DOI]

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Mahabeleshwar GH, Kundu GC. Syk, a protein-tyrosine kinase, suppresses the cell motility and nuclear factor kappa B-mediated secretion of urokinase type plasminogen activator by inhibiting the phosphatidylinositol 3'-kinase activity in breast cancer cells. J Biol Chem. 2003;278:6209-6221.  [PubMed]  [DOI]

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