理肠四方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织TNF- mRNA表达的影响

摘要

目的: 观察理肠四方对溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠组织细胞因子TNF-mRNA的表达的影响, 比较四方疗效大小, 并分析其作用机制.

方法: 应用2, 4-二硝基氯苯(DNCB)免疫加醋酸局部灌肠法建立UC大鼠模型, 将98只健康SD大鼠(雌雄各半), 按雌雄随机分7组, 分别为乌梅丸组、白头翁汤组、参苓白术散组、痛泻要方组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组、模型组和正常组, 分别观察治疗后大鼠结肠黏膜TNF-mRNA的表达变化, 并进行统计学比较.

结果: 造模后细胞因子TNF-mRNA的表达升高(模型组与正常组平均吸光度比较P<0.01, t =4.128 vs 正常组), 理肠四方各治疗组、SASP组与模型组比较有显著意义(P<0.01, q =12.37vs乌梅丸组, q =9.52 vs 白头翁汤组, q =8.79 vs 参苓白术散组, q =8.54 vs 痛泻要方组, q =8.92 vs SASP组), 但除乌梅丸外, 理肠四方之间比较无明显差异.

结论: 经两两比较后, 乌梅丸疗效最好, 白头翁汤、参苓白术散、痛泻要方与SASP组疗效相当. 表明理肠四方可下调促炎细胞因子TNF-, 从而使溃疡性结肠炎大鼠免疫功能恢复正常, 达到治疗的目的.

关键词: N/A

Effect of Chinese herb compounds Lichangsifang on TNF- mRNA expression of colon tissue in rats with ulcerative colitis

Ming-Yi Qiu, Heng Fan, Jia-Jun Mei, Guan-Xin Shen, Song-Lin Liu, Ying-Qian Zhao

Ming-Yi Qiu, Jia-Jun Mei, Song-Lin Liu, Ying-Qian Zhao, Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China

Heng Fan, Department of Integrated Traditional and Western Medicine, Xiehe Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Guan-Xin Shen, Xiehe Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Supported by: Hubei Provincial Department of Education, No. 99Z014.

Correspondence to: Ming-Yi Qiu, Hubei College of Traditional Chinese Medicine, 1 Tanhualin, Wuchang 430061, Hubei Province, China. qiumingyi9256@163.com

Received: June 6, 2003
Revised: July 5, 2003
Accepted: July 30, 2003
Published online: March 15, 2004

Abstract

AIM: To study the effect of Lichangsifang (LCSF) on TNF- mRNA expression in rats with ulcerative colitis (UC).

METHODS: Ninty-eight SD rats were randomly divided into seven groups, and every group had fourteen rats (seven rats were male, and seven, female), namely the normal control group, the pathologic control group, solfasalazine (SASP) group, Wumeiwan (WMW) group, Baitouwengtang (BTWT) group, Senglingbaishusan (SLSS) group and Tongxieyaofang (TXYF) group. Except the normal control group, the other six animal model groups of UC were made through the integration of general immunity and local stimulation with DNCB and acetic acid. The six animal model groups of UC were treated by SASP, TXYF, WMW, BTWT, SLBSS and TXYF respectively. After these treatment, the changes of some immune indexes in the colon tissue such as the lever of TNF-mRNA expression were evaluated by in situ hybridization.

RESULTS: The level of TNF-mRNA expression in pathologic groups was significantly higher than that in normal controls (P < 0.01, t =4.128 vs normal control), TNF-mRNA expression was decreased in WMW than those in other pathologic groups (P < 0.01, t =3.435 or P < 0.05 t =2.593). TNF-mRNA expression was decreased in WMW group than those in BTWT group, SLBSS group and TXYF group (P < 0.05, q =2.581 vs BTWT group, q =2.834 vs SLBSS group, q =2.624 vs TXYF group). There was no remarkable difference in the lever of TNF-mRNA expression among BTWT group, SLBSS group and TXYF group (P > 0.05).

CONCLUSION: This model induced with DNCB and acetic acid is successful. It is obvious that the cytokines play important roles in pathogenesis of UC, especially proinflammtory cytokines TNF-, which can promote inflammation. WMW is the most effective among the compounds, which have curative effects by adjusting immunity and inhibiting abnormal inflammatory reaction in the course of UC.

Key Words: N/A

0 引言

细胞因子与溃疡性结肠炎(UC)关系密切, 其中TNF-是公认的以单核巨噬细胞产生为主的、能介导UC发病的细胞因子[1-5]. 有人已进一步证实: TNF-mRNA的表达在活动期高于非活动期UC[6]. 我们用UC大鼠结肠TNF-mRNA表达为观察指标, 以进一步了解中药理肠四方对UC细胞因子的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

理肠四方的药物组成及剂量如下: 乌梅丸: 乌梅16 g, 细辛6 g, 干姜10 g , 黄连16 g, 当归4 g, 附子6 g, 蜀椒4 g, 桂枝6 g , 生晒参6 g , 黄檗6 g ; 白头翁汤: 白头翁30 g, 黄柏24 g, 黄连10 g , 秦皮24 g ; 参苓白术散: 莲子肉10 g, 薏苡仁10 g , 缩砂仁10 g , 桔梗10 g , 白扁豆15 g, 白茯苓20 g , 生晒参20 g, 甘草20 g, 白术20 g, 山药20 g ; 痛泻要方: 炒白术30 g, 白芍20 g, 陈皮15 g, 防风20 g. 柳氮磺胺吡啶(SASP)批号200111002, 由上海三维制药公司生产(250 mg/片). 乌梅丸: 将生药中含挥发油的药物(当归、细辛、木香等)放入提油器中, 加蒸馏液(含挥发油), 用乙醚溶解, 再蒸发乙醚, 得挥发油(2 mL). 再将以上药液(包括药渣)倒入药罐中, 将其他不含挥发油的药物亦加入此药罐, 开始用武火, 煮沸后用文火, 保持沸腾30 min, 搅拌后趁热过滤. 其药渣再加蒸馏水蒸煮一次, 煮沸时间20 min, 过滤, 合并滤液, 在电炉上浓缩成515 g/L, 再将蒸馏的植物油加入此药液中, 消毒后分两瓶装, 压盖备用. 白头翁汤、参苓白术散、痛泻要方等三方药物的制备均按以上方法配制成含生药浓度分别为562 g/L、987 g/L、216 g/L的水煎剂. 柳氮磺胺吡啶药物制备: 将88片SASP用研钵研细, 用100目筛筛过, 然后再研, 直至最后剩下1-2 g残渣, 仍放进研粉中, 将研粉配成26 g/L混悬液. TNF-原位杂交检测试剂盒、原位杂交专用盖玻片、DBA显色试剂盒、poly-L-lysine(多聚赖氨酸)、DEPC、200 mL/L甘油等均由武汉博士德生物工程有限公司提供. 健康SD大鼠98只(雌雄各半, 体质量300±50 g)由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.

1.2 方法

将SD 健康大鼠98只(雌雄各半), 按雌雄随机分7组, 每组14只(雌雄各半), 1-6组为造模组, 分别为乌梅丸组、白头翁汤组、参苓白术散组、痛泻要方组、SASP组和模型组, 第7组为正常组, 各组体质量无显著性差异(P>0.05). 应用2, 4-二硝基氯苯(DNCB)免疫加醋酸局部灌肠法建立UC大鼠模型[7-8]. 将大鼠颈背部用100 g/L Na2S脱毛后, 以20 g/L DNCB丙酮液0.25 mL (5滴)滴背, 1次/d, 连续14 d, 在第15 d以直径3 mm导尿管经肛门插入结肠8 cm处, 注入0.1% DNCB乙醇0.25 mL, 在第16 d同部位注入80 mL/L醋酸溶液2 mL, 准确计时10 s后, 再用5 mL生理盐水冲洗. 再饲养2 wk, 每天观察大鼠大便性状、饮食、毛发、活动状态等, 可以看到大鼠逐渐产生典型UC活动期症状, 30 d后造模完成. 然后, 每组随机抽取大鼠2只, 处死后取其结肠, 进行病理检查确认结肠出现的充血、水肿、炎细胞浸润、隐窝脓肿、杯状细胞减少、腺体破坏及小溃疡形成等一系列变化. 每组每只大鼠分别用乌梅丸液、白头翁汤液、参苓白术散液、痛泻要方液和SASP混悬液3 mL灌胃, 每天1次; 模型组、正常组: 每组每只大鼠均以蒸馏水各3 ml灌胃, 1次/d, 以上均给药15 d. 全部结肠标本均经49 g/L甲醛固定, 石蜡包埋. TNF-mRNA的表达用原位杂交法(采用TNF-的寡核苷酸探针经地高辛高效标记法)检测, 严格按试剂盒说明操作, 最后显微镜观察并拍照. 每组切片随机选取5张, 各随机选取5个视野, 用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统(版本9.0)测量, 计算其平均吸光度和平均灰度.

统计学处理 采用SPSS10.0软件处理统计数据资料, 数据用均数±标准差(mean±SD)表示, 采用t检验和F分析(q检验).

2 结果

造模动物于2 wk左右出现黏液稀便, 且逐渐加重, 4 wk左右症状更为严重, 可见脓血便、消瘦、体质量减轻、毛发无光泽、饮食明显减少、畏寒、懒动等. 经理肠四方、SASP灌胃后, 其症状均有不同程度改善(表1).

表1 中药理肠四方对大鼠体质量和组织损伤积分的影响(mean±SD).

分组	n	体质量(g)	损伤积分
正常组	12	352.5±20.7b	0b
模型组	10	3 307.8±15.3d	5.5±0.45d
S A S P组	9	3 321.5±18.7ad	3.8±0.39a
乌梅丸组	11	3 340.3±16.8bd	1.8±0.34bf
白头翁汤组	10	3 331.4±13.8bd	2.5±0.38bf
参苓白术散组	9	3 325.6±18.4ad	1.9±0.35be
痛泻要方组	10	3 328.7±10.5ad	3.7±0.47a

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 模型组; ^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 正常组;

^eP<0.05,

^fP<0.01 vs SASP组.

2.1 根据炎症损伤程度进行评分[9-12], 确有改善(表1). 镜下正常组: 大鼠结肠黏膜完好, 无炎细胞浸润及溃疡形成, 黏膜上皮完整、连续, 腺体排列规则, 结构清楚, 分泌功能活跃, 黏膜、固有膜内血管、纤维等正常, 肌层无异常. 模型组: 大鼠结肠黏膜糜烂、溃疡, 大部分黏膜缺损, 有的形成深大溃疡, 黏膜腺体破坏, 残存的黏膜充血、水肿、增生形成息肉样外观(假息肉), 黏膜及黏膜下大量炎细胞浸润(淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞), 有的细胞呈散在分布, 处于增生状态(浆多、核大、染色质稀疏); 黏膜层变薄、黏膜下固有层局部充血、水肿、纤维增生. SASP组: 大鼠结肠黏膜上皮部分缺损, 腺体排列欠规则, 黏膜下轻度充血, 较多炎细胞浸润. 乌梅丸组: 大鼠结肠黏膜上皮基本完整, 腺体排列较规则, 黏膜下无明显充血, 少量炎细胞浸润. 白头翁汤组: 大鼠结肠黏膜上皮基本完整, 腺体排列规则, 黏膜下充血不明显, 可见炎性细胞浸润. 参苓白术散组: 大鼠结肠黏膜上皮基本完整, 腺体排列规则、黏膜充血不明显, 可见少量炎性细胞浸润. 痛泻要方: 大鼠结肠黏膜上皮欠完整, 腺体排列欠规则, 黏膜下充血明显. 可见炎性细胞浸润(图1A-G).

图1 UC大鼠结肠病理切片HE×200. A: 正常组; B: 模型组; C: SASP组; D: 乌梅丸组; E: 白头翁汤组; F: 参苓白术散组; G: 痛泻要方组.

2.2 TNF-mRNA的表达

杂交阳性信号为棕黄色颗粒分布于胞质, 阳性物质主要位于巨噬细胞、淋巴细胞及纤维母细胞胞质内, 呈颗粒状(图2A-G). 模型组平均吸光度明显高于正常组(P<0.01), 其平均灰度则明显低于正常组(P<0.01); 而乌梅丸组平均吸光度低于模型组(P<0.05), 其平均灰度则明显高于模型组(P<0.01); 乌梅丸组平均光密度与白头翁汤组、参苓白术散组、痛泻要方组比较亦有所下降(P<0.05), 其平均灰度则较之升高(P<0.05); 而SASP组其平均吸光度、平均灰度则与该3组无明显差别(P>0.05, 表2).

表2 中药理肠四方对大鼠结肠组织TNF-mRNA的表达情况(mean±SD).

分组	n	平均吸光度	平均灰度
正常组	12	0.31±0.13b	158.21±12.31b
模型组	10	0.68±0.16	90.57±9.73
SASP组	9	0.48±0.09	125.36±11.27
乌梅丸组	11	0.37±0.11ac	140.48±13.34bd
白头翁汤组	10	0.45±0.15e	130.93±10.43e
参苓白术散组	9	0.47±0.14e	127.89±9.67e
痛泻要方组	10	0.50±0.13e	123.81±12.03e

^aP<0.05 ,

^bP<0.01 vs 模型组;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs SASP组;

^eP<0.05 vs 乌梅丸组.

图2 UC大鼠结肠TNF- mRNA表达×200. A: 正常组; B: 模型组; C: SASP组; D: 乌梅丸组; E: 白头翁汤组; F: 参苓白术散组; G: 痛泻要方组.

3 讨论

从大鼠主要症状、体征、结肠组织损伤积分特别是病理切片看, 该造模方法是成功的, 同时通过药物治疗后症状、体征及病理改变看, 他们均有不同程度好转(组间变化不明显P>0.05), 其中以白头翁汤组疗效最好, 而痛泻要方组疗效稍差(与SASP组相当), 而乌梅丸组与参苓白术散组疗效相当(主要根据结肠组织积分结果看). 乌梅丸较其他各组对TNF-mRNA的影响为大, 其疗效可能稍好于其他各组. 主要是所造UC大鼠模型造成机体损伤及炎症, 既有正虚又有湿热, 其UC("休息痢")发病机制与乌梅丸组方特点相吻合, 亦即与乌梅丸的主治病机较为合拍, 故该方疗效最好; 白头翁汤专事清热化湿, 参苓白术散专擅健脾益气, 前者祛邪, 后者以补虚扶正, 而针对肝脾不和的痛泻要方则与此模型病机有较大差异, 其疗效均较乌梅丸次之, 故疗效稍差.

肿瘤坏死因子(TNF-)是一种重要的肠道炎症递质和凋亡诱导递质, TNF-介导的细胞凋亡与抗原刺激后成熟T细胞清除有关[13]. UC肠黏膜巨噬细胞合成TNF-, 而TNF-的增加诱导结肠上皮细胞凋亡, 促进UC的发生. 大量证据表明, TNF-是由单核巨噬细胞产生的一种肽类物质, 他是一类具有多种生物学活性的细胞因子, 不仅对人或动物等多种肿瘤细胞有细胞毒性作用, 而且是机体炎症与免疫反应的重要调节因子, 发生UC时, 由肠道菌群产生的脂多糖可直接活化黏膜固有层的吞噬细胞, 使其增生, 进而释放包括TNF-在内的一系列细胞因子, 破坏肠黏膜屏障, 同时血管系统也遭到破坏, 导致一系列UC典型的炎症病变. 另外, TNF-的分泌是可以调控的, 然而细胞因子调控和释放的确切机制仍不清楚, 是否的确与核因子(NF)-B活化有关[14], 尚需进一步研究.

备注

编辑: N/A

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