病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2004. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2004-03-15; 12(3): 590-593
在线出版日期: 2004-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i3.590
人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达
刘秋平, 贾战生, 杜德伟, 李光玉, 潘蕾, 魏欣, 罗新栋, 王全楚
刘秋平, 贾战生, 杜德伟, 李光玉, 潘蕾, 魏欣, 罗新栋, 王全楚, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
刘秋平, 女, 1972-10-15生, 陕西省岐山县人, 汉族, 1996年西安医科大学学士, 第四军医大学唐都医院感染病诊疗中心硕士, 主治医师, 主要从事病毒性肝炎发病机制的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30070687.
通讯作者: 贾战生, 710038, 陕西省西安市灞桥区新寺路1号, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心. jiazsh@fmmu.edu.cn
电话: 029-3377742 传真: 029-3537377
收稿日期: 2003-09-15
修回日期: 2003-10-01
接受日期: 2003-10-22
在线出版日期: 2004-03-15

目的: 构建含人CD81基因的真核表达载体, 探讨CD81在COS-7细胞的表达, 为研究丙型肝炎病毒(HCV)与CD81相互作用奠定基础.

方法: 从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81, 应用双酶切回收基因片段, 定向克隆入真核表达载体pVAX1; 通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞; 应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物.

结果: 重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确, 并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白.

结论: 成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81, 并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子, 该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型.

关键词: N/A
引文著录: 刘秋平, 贾战生, 杜德伟, 李光玉, 潘蕾, 魏欣, 罗新栋, 王全楚. 人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达. 世界华人消化杂志 2004; 12(3): 590-593
Construction of human CD81 eukaryotic expression vector and expression of the gene segment in COS-7 cell line
Qiu-Ping Liu, Zhan-Sheng Jia, De-Wei Du, Guang-Yu Li, Lei Pan, Xing Wei, Xin-Dong Luo, Quan-Chu Wang
Qiu-Ping Liu, Zhan-Sheng Jia, De-Wei Du, Guang-Yu Li, Lei Pan, Xing Wei, Xin-Dong Luo, Quan-Chu Wang, The Center of Diagnosis and Treatment for Infectious Diseases of PLA, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shannxi Province, China.
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30070687.
Correspondence to: Dr. Zhan-Sheng Jia, Center of Diagnosis and Treatment for Infectious Diseases of PLA, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shannxi Province, China. jiazsh@fmmu.edu.cn
Received: September 15, 2003
Revised: October 1, 2003
Accepted: October 22, 2003
Published online: March 15, 2004

AIM: To construct a human CD81 eukaryotic expression vector and to analyze the expression of CD81 in COS-7 cells.

METHODS: CD81 gene from the pMD18-T-CD81 vector with double-enzyme digestion was cloned into the pVAX1 eukaryotic expression vector, named pVAX1-CD81. The recombinant vector pVAX1-CD81 and pVAX1 as controls were transfected into COS-7 cells by lipofectamine, and the transient expression product on the transfected cells was analyzed with anti-CD81 monoclonal antibody by indirect immunofluorescence assay (IFA).

RESULTS: The identification of the eukaryotic expression vector pVAX1-CD81 by PCR and restriction enzyme analysis showed that CD81 gene was rightly inserted into the vector; and the product of the CD81 gene was successfully expressed on surface of COS-7 cells.

CONCLUSION: The eukaryotic expression vector with CD81 gene is constructed and efficiently expressed in COS-7 cells. The results indicate that the transfected CD81 cells will need to further studies on the roles of CD81 in the process of HCV infection and entrance to cells.

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)为单股、正链、RNA包膜病毒, 其包膜糖蛋白与细胞表面受体或辅助分子相互作用, 介导病毒入胞是HCV感染致病的关键[1-5]. 目前的研究表明, CD81作为HCV的侯选受体之一可能在HCV 感染靶细胞过程中发挥重要作用[6-8]. CD81分子又称增生抗体靶抗原-1(TAPA-1), 属于四次跨膜超家族成员(TM4-SF), 是一种细胞膜表面黏附分子, 分布于多种细胞, 参与细胞的黏附、变形、活化、增生及信号转导等多种功能[9-11]. 我们已成功从人Molt-4细胞克隆了CD81的全编码基因, 并经酶切鉴定和序列分析表明其核苷酸序列完全正确. 本研究通过构建人CD81基因真核表达载体, 转染COS-７细胞, 探讨CD81分子的表达, 为研究HCV与CD81的相互作用, 阐明HCV感染细胞的机制提供依据.

1 材料和方法
1.1 材料

pMD18-T-CD81载体由本室先前构建, 真核表达载体pVAX1由本室王福祥博士惠赠, 大肠杆菌菌株JM109由本室保存. 绿猴COS-7细胞由第四军医大学免疫教研室刘雪松博士惠赠. DNA抽提纯化试剂盒购自华舜生物工程有限公司, 限制性内切酶BamHⅠ, XbaⅠ, T4 DNA连接酶为Takara公司产品. Lipofectamine 2000购自Invitrogen试剂公司, 细胞培养所用RPMI 1640, DMEM(高糖型), 回收纯化试剂盒为Gibco公司产品. 鼠抗人的CD81 mAb为Labvision公司产品, FITC标记的羊抗鼠的IgG购自华美公司.

1.2 方法

用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切pMD18-T-CD81, 回收大小约729 bp的CD81基因片段, 同时准备pVAX1载体, 确定二者的连接比例和条件, 应用T4DNA连接酶在16 ℃条件下连接目的基因与载体, 转化大肠杆菌JM109, 次日挑取卡那霉素抗性的阳性克隆, 扩增、提取质粒, 获得含CD81的真核表达质粒pVAX1-CD81. 应用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组的真核表达质粒pVAX1-CD81. 应用先前研究设计合成的引物, 以pVAX1-CD81为模版, 进行PCR反应, 其反应体系为: pVAX1-CD81 2 L, 上、下游引物各1 L, Taq DNA聚合酶 0.5 L, dNTPs 2 L, MgCl2 1.5 L, Buffer 2 L, 去离子水 10 L至终体积20 L. 反应参数为: 95 ℃预变性 3 min, 94 ℃变性30 s, 64 ℃退火30 s, 72 ℃延伸 45 s, 35个循环, 72 ℃再延伸10 min. 对重组质粒双酶切产物、PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳.取传代的绿猴COS-7细胞, 用含100 ml/L胎牛血清(含1×103u/L青霉素及100 mg/L链霉素)的DMEM培养基37 ℃ 50 ml/L CO2培养, 细胞在转染前24 h传代, 待细胞汇合达80% 时, 更换为无血清含Lipofectamine 2000包裹重组质粒 pVAX1-CD81的DMEM培养液, 以空载体pVAX1为对照, 具体操作按说明书进行, 转染6 h后更换为含血清的DMEM继续培养.应用转染pVAX1-CD81的COS-7细胞, 分别培养24, 48, 72, 和144 h, 制备细胞爬片, 冷丙酮固定, 吹干. 以鼠抗人的CD81 mAb为一抗, 进行间接免疫荧光染色, 荧光显微镜观察, 以空载体pVAX1作为阴性对照.

2 结果
2.1 真核表达载体pVAX1-CD81的鉴定

pMD18-T-CD81载体为本室先前构建的原核载体, 为使CD81能在真核细胞表达, 我们重组了真核表达载体pVAX1-CD81, 其两端分别有BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点. 对pVAX1-CD81应用双酶鉴定, 切下一约729 bp的小片断和约3 000 bp的载体大片断, 与预期结果完全相符. 应用PCR扩增, 得到约729 bp的片段, 而对照组(空载体pVAX1)用相同的引物, 未见条带出现(图1). 结果表明CD81全序列基因成功插入真核表达载体.

图1
图1 重组质粒pVAX1-CD81的酶切及PCR鉴定. 1: Marker(DL 15 000); 2: pVAX1-CD81/ BamHⅠ; 3: pVAX1-CD81; 4: pVAX1-CD81/ BamHⅠ+XbaⅠ; 5: pVAX1-CD81/PCR; 6: pVAX1/PCR; 7: Marker(DL 2 000).
2.2 pVAX1-CD81在COS-7细胞中的表达

pVAX1为一瞬时高效真核载体, 缺乏抗性筛选.重组质粒pVAX1-CD81经脂质体介导转染COS-7细胞, 选取转染不同时间制备的细胞爬片, 进行间接免疫荧光检测. 结果表明, 转染pVAX1-CD81后48和72h , COS-7细胞表面有较强的绿色荧光, 而空载体pVAX1的细胞膜上未见荧光(图2), 延长培养时间细胞膜荧光强度明显减弱. 结果说明, 我们成功地克隆人CD81全序列基因, 构建的真核表达载pVAX1-CD81可有效地在绿猴COS-7细胞表达人CD81分子, 该转染细胞可为进一步研究HCV与CD81的相互作用提供受体重建模型.

图2
图2 pVAX1-CD81转染48 h的COS-7细胞IF×200. A: 转染pVAX1; B: 转染pVAX1-CD81.
3 讨论

HCV是引起慢性肝脏疾病的主要原因之一[12-17], HCV感染后约70%转化为慢性[18-22], 并与肝硬化、肝衰竭和肝癌的发生密切相关[23-25]. 与大多数包膜病毒一样, HCV可能通过其表面包膜糖蛋白与靶细胞表面受 体分子结合, 并进入肝细胞是感染致病的关键[1,2,5,26]. 因此, 克隆HCV受体对于研究HCV包膜糖蛋白与受体分子的作用, 探讨HCV感染、发病机制和抗病毒治疗以及疫苗制备具有重要意义. 近年来, 国外学者在缺乏天然病毒颗粒的条件下, 应用真核细胞表达HCV E 2包膜糖蛋白、E1-E2糖蛋白脂质体、类病毒颗粒等[27-32], 在体外模拟研究病毒与细胞的相互作用, 相继发现细胞表面CD81、低密度脂蛋白受体(LDL-R)[33-37]、B I型清道夫受体(SR-BI)[38-39]、树突状细胞特异性细胞间黏附分子扑获的非整合素分子(DC-SIGN)和淋巴细胞特异性细胞间黏附分子扑获的非整合素分子(LC-SIGN)[40-42] 等参与了对HCV的结合和黏附, 可作为HCV的侯选受体. CD81是目前关于HCV感染入胞研究最多的侯选受体. CD81在四次跨膜过程中形成两个胞外区EC1(extro-cellular domain 1)和EC2(extro-cellular domain 2). 近年来, 许多学者应用重组的HCVE1和E2包膜蛋白在体外研究结果表明, 在HCV结合过程中CD81的两个膜外区EC2和EC1各起不同作用, 其中EC2是HCV-E2的识别结合部位, EC1不参与HCV-E2的结合. 应用可溶性E2分子和抗CD81单克隆抗体可以阻断这种结合[28-29]. 然而, HCV-E2与CD81的结合能否导致HCV进入靶细胞, 并在细胞内复制、致病还不清楚.由于缺乏HCV体外感染的传代细胞模型, 限制了对HCV感染致病机制的研究.

应用受体重建方法作为确定病毒受体地位的重要方法之一, 已在多种病毒受体研究中得到证明[43-47]. 通过基因转染方法改造非易感细胞, 使其表达病毒受体, 并获得易感性是受体重建的基本思路. 我们先前的研究表明, 成功地从富含人CD81的Molt-4细胞克隆了人CD81全序列基因, 构建了载体pMD18-T-CD81, 两端分别带有BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点, 并经测序分析其核苷酸与GeneBank公布的序列完全一致. 为了进一步探讨CD81在HCV的感染中的作用, 本研究应用基因重组方法成功构建了含人CD81全序列基因的真核表达载体pVAX1-CD81, 并在绿猴肾COS-7细胞证明, 转染的COS-7细胞在转染后48 h能够有效地表达人CD81分子.有研究表明, CD81分子具有种属特异性, 不同种属CD81与HCV亲和力的大小不同, 对HCV易感性的高低也不一致[29]. COS-7 细胞为非洲绿猴肾细胞的衍生细胞系, 虽然猴的CD81和人的CD81 高度相似, 但二者的抗原性不同. 本研究选择COS-7细胞为靶细胞有两方面考虑[33]: 其一, 该细胞为异种细胞并不表达CD81, 抗人CD81单抗与猴CD81无交叉反应; 其二, 体外应用HCV血清感染实验表明, COS-7细胞为非易感细胞, 通过转染人CD81基因证明, pVAX1-CD81在COS-7细胞膜上可高效表达人CD81分子, 如能介导HCV阳性血清感染细胞, 可证实CD81的受体地位, 可为进一步研究干扰阻断病毒与受体结合药物的研发及疫苗的制备提供感染细胞模型, 为从分子水平阐明HCV的致病机制奠定基础.

编辑: N/A

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