胃癌 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2004. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2004-03-15; 12(3): 533-536
在线出版日期: 2004-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i3.533
中药复方胃康宁对人胃癌细胞VEGF及其受体表达的作用
闵存云, 李庆明, 吴伟康
闵存云, 李庆明, 吴伟康, 中山大学中西医结合研究所 广东省广州市 510120
闵存云, 男, 1970-05-09生, 云南省陆良县人, 汉族. 中山大学博士生, 主要从事消化系统疾病的临床及实验研究.
通讯作者: 闵存云, 510120, 广东省广州市沿江西路107号, 中山大学中西医结合研究所. drmincunyun888@yahoo.com.cn
电话: 020-81332037 传真: 020-81332853
收稿日期: 2003-06-27
修回日期: 2003-08-06
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-03-15

目的: 研究胃癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flt、KDR的表达与中药胃康宁的调控作用.

方法: 以不同剂量的中药复方胃康宁制剂给SD大鼠灌胃制备含药血清, 然后以含药血清培养胃癌细胞, 共同培养两代后, 分别用免疫组化法和RT-PCR检测不同剂量组胃癌细胞中VEGF及其受体Flt、KDR的表达情况.

结果: 与对照组(VEGF162.78±0.58, Flt: 172.65±0.65)相比, VEGF及其受体Flt在用药组胃癌细胞中的表达减弱, 染色变浅(VEGF: 186.82±0.22, 195.35±0.45, 172.62±0.52, Flt: 198.44±0.44, 188.66±0.46, 197.01±0.91, P<0.05), 并且与用药剂量有一定的关系; VEGF mRNA及其受体Flt mRNA、KDR mRNA在用药组胃癌细胞中的表达也受到抑制.

结论: 中药胃康宁对胃癌细胞血管内皮生长因子及其受体Flt、KDR的表达有抑制作用.

关键词: N/A
引文著录: 闵存云, 李庆明, 吴伟康. 中药复方胃康宁对人胃癌细胞VEGF及其受体表达的作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(3): 533-536
Effect of Chinese medicine Weikangning on expression of VEGF and its receptors Flt and KDR in gastric carcinoma cells
Cun-Yun Min, Qing-Ming Li, Wei-Kang Wu
Cun-Yun Min, Qing-Ming Li, Wei-Kang Wu, The Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Correspondence to: Cun-Yun Min, The Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sun Yat-Sen University, 107 Yianjiang Xilu, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China. drmincunyun888@yahoo.com.cn
Received: June 27, 2003
Revised: August 6, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: March 15, 2004

AIM: To study effect of traditional Chinese medicine Weikangning (WKN) on the expression of VEGF and its receptors Flt and KDR in gastric carcinoma cells.

METHODS: We used different dosage of WKN on rats to prepare serum containing WKN.The gastric carcinoma cells were cultured in the RPMI1640 media with serum containing WKN for 48 h. The expression of VEGF, Flt-1 and KDR was determined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry in gastric cancer cell lines respectively.

RESULTS: All gastric cancer cell lines analyzed expressed VEGF Flt-1 and KDR. But the expression of fVEGF (186.82±0.22, 195.35±0.45, 172.62±0.52), Flt-1 (198.44±0.44, 188.66±0.46, 197.01±0.91) in cells cultured in serum containing WKN decreased in a dose-dependent manner as compared with control (VEGF162. 78±0.58, Flt: 172.65±0.65)(P < 0.05).

CONCLUSION: VEGF and its receptors KDR and Flt-1 are expressed widely in gastric carcinoma cells and WKN can inhibit their expression.

Key Words: N/A
0 引言

恶性肿瘤生长的基础是肿瘤组织内血管的再生[1-5], 肿瘤细胞分泌的生长因子可调节肿瘤组织内血管的再生[6-9]. 此外, 肿瘤细胞分泌的生长因子对肿瘤细胞本身的生长也存在一定的作用. 在这些生长因子之中, 血管内皮生长因子(VEGF)的作用最引人注目[10]. 我们通过观察VEGF及其受体Flt, KDR在胃癌细胞中的表达与中药胃康宁的调控作用, 探讨中医中药对胃癌的作用机制.

1 材料和方法
1.1 材料

TRIzol、PCR试剂盒均为GIBCO公司产品. VEGF及其受体Flt的抗体、SABC试剂盒、DAB显色液由博士德公司提供. MGC-803胃癌细胞株和Wistar ♂大鼠, 清洁级, 由中山大学实验动物中心提供. 中药胃康宁由党参、半枝莲、五灵脂等组成. 用各种药物的颗粒剂(由江苏省江阴制药厂提供), 分别制成1 kg生药/L及2 kg生药/L浓度, 加防腐剂苯甲酸(1 g/L)、4℃冷藏保存, 供大鼠灌胃、制备含药血清之用. 胃康宁含药血清制备: Wistar♂大鼠, 清洁级, 质量120-150 g, 共120只, 随机分为4组. 低剂量组按生药5 g/kg, 中剂量组按10 g/kg, 高剂量组按20 g/kg灌胃, 对照组给予相同体积的生理盐水, 1次/d, 连灌1 wk. 末次灌药后1 h在无菌条件下自腹主动脉采血, 1 700 r/min离心制备含药血清; 将所采各组动物血清分别混合, -70 ℃冷藏备用, 临用前需56 ℃灭活30 min.

1.2 方法

复苏MGC-803胃癌细胞株, 体外传代培养, 待培养瓶底铺满胃癌细胞后, 弃去培养液, 2.5 g/L胰蛋白酶消化胃癌细胞, 用新鲜含100 ml/L小牛血清RPMI 1640培养液调整细胞密度为2×108/L. 设空白对照组、正常大鼠血清对照组、胃康宁含药血清高、中、低剂量实验组共5组. 共同培养两代后进行检测. 将胃癌细胞按1×108/L的密度均匀接种于培养瓶中, 共同培养两代后, 用免疫组化法检测VEGF及其受体Flt, 采用SABC试剂盒, 按说明书进行操作. 结果采用德国KONTRON IBAS2.0全自动图像处理系统进行定量分析. 胃癌细胞内总RNA的提取采用异硫氰酸胍-酚一步法, 采用GIBCO公司的TRIzol, 按说明书进行操作. 提取后的RNA于-70 ℃冰箱保存备用. 参照人VEGF, KDR, FLT-1mRNA的序列设计引物, 上海博亚生物技术公司合成, 引物序列: VEGF正向引物为5'TTGCTGCTCTACCTCCAC3', 反向引物为5'AATGCTTTCTCCGCTCTG3', FLT-1正向引物为5'CAA GTG GCC AGA GGC ATG GAG TT 3', 反向引物为5'GAT GTA GTC TTT ACC ATC CTG TTG3', KDR正向引物为 5'GAG GGC CTC TCA TGG TGA TTG T3', 反向引物为5'TGC CAG CAG TCC AGC ATG GTC TG3', -actin 正向引物为5'CTAYYGGCAACGAGCGGTTC3', 反向引物为 5'CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT3', VEGF的反应条件为: 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 30个循环, 72 ℃延伸7 min; Flt, KDR的反应条件为: 95 ℃ 2 min, 94 ℃ 1 min, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 30个循环, 72 ℃延伸7 min. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳, EB染色后拍照, 并用全自动图像处理系统分别测量电泳条带的面积(AREA)、平均吸光度(OPTDM)及二者的乘积(OPTDI)进行定量分析. 试验中分别设立空白对照和各样本的-actin对照.

统计学处理 检测结果用SPSS软件进行统计学分析.

2 结果
2.1 VEGF及其受体Flt的表达

所有胃癌细胞中均可见VEGF和Flt表达, 但与对照组相比, 用药组胃癌细胞中VEGF和Flt的表达减弱, 并且与用药剂量相关(表1, 图1).

表1 胃癌细胞VEGF及其受体Flt表达的灰度值(mean±SD).
分组VEGFFlt
高剂量组186.82±0.22b198.44±0.44b
中剂量组195.35±0.45b188.66±0.46b
低剂量组172.62±0.52b197.01±0.91b
血清组165.11±0.65177.68±0.48
对照组162.78±0.58172.65±0.65
bP<0.01 vs 对照组.
图1
图1 各组免疫组化图. A: VEGF高剂量组(10×40); B: VEGF中剂量组(10×40); C: VEGF低剂量组(10×40); D: Flt高剂量组(10×40); E: Flt中剂量组(10×40); F: Flt低剂量组(10×40); G: VEGF正常对照组(10×40); H: Flt正常对照组(10×40).
2.2 胃康宁对VEGF, Flt, KDR mRNA表达的影响

所有胃癌细胞中均可见VEGF、Flt和KDR mRNA表达, 但与对照组相比, 用药组胃癌细胞中VEGF, Flt和KDR mRNA的表达相对减弱, 并且与用药剂量有一定的关系(表2, 图2).

表2 胃康宁对VEGF及其受体KDR、Flt mRNA表达的影响.
指标对照组血清组低剂量组中剂量组高剂量组
VEGFAREA297261192bd134bd120d
OPTDM0.170.1520.14bd0.107bd0.072d
OPTDI50.839.55525.9bd14.4bd8.6d
FltAREA306271247bd197bd111d
OPTDM0.41c0.3680.34bd0.275bd0.061d
OPTDI124.599.684.0bd54.3bd6.8d
KDR AREA408272239bd178bd79d
OPTDM0.2820.2370.162bd0.15bdd0.112d
OPTDI115.235.844.2bd19.9bd18.8d
dP<0.01 vs 对照组;
bP<0.01 vs 高剂量组.
图2
图2 各组电泳图. A: VEGF图中自左至右分别为: Maker, 高剂量组, 中剂量组, 低剂量组, 血清对照组, 正常对照组; B, C: Fnt与KDR图中自左至右分别为: 高剂量组, 中剂量组, 低剂量组, 血清对照组, 正常对照组, Marker.
3 讨论

血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤细胞系中的一种新型生长因子, 他特异性地作用于血管内皮细胞, 促进血管内皮细胞增生. 对原位肿瘤的形成和生长以及转移瘤的形成中起着十分重要的作用[1-4]. VEGF在胃癌细胞中广泛表达[10-13], VEGF促进血管的形成是胃癌发生浸润、转移的机制之一[14-16], VEGF-C和VEGF-D的表达更是胃癌细胞淋巴结转移的重要标志[17-19]. VEGF的水平不仅与胃癌的预后有关, 更与治疗效果密切相关[20-22]. 近年的一些研究显示, VEGF还具有旁分泌作用[23]. 抗VEGF mAb能抑制肿瘤的生长和转移, 反义VEGF mRNA通过和VEGF mRNA核苷酸碱基互补结合, 抑制VEGF的翻译过程, 并促进VEGF mRNA的降解从而可以抑制VEGF的表达与分泌[24]. VEGF受体Flt-1结合小肽能与人脐静脉内皮细胞、肿瘤细胞结合, 抑制新生血管的形成, 促进肿瘤组织坏死及显著抑制肿瘤生长[25].

近年对中医中药的研究表明, 健脾益气类中药及复方既可提高胃癌患者的免疫功能、改善其生存质量, 又可增强抗肿瘤药物的疗效, 降低其毒副作用[26]. 而健脾益气, 活血化瘀的中药复方则具有诱导和促进肠化细胞、异型增生细胞分化成熟, 抑制和纠正细胞的异常增生及保护胃黏膜作用[27]. 崔儒涛[28]用具有健脾, 活血, 解毒作用的乐胃煎治疗以MNNG诱导的大鼠胃癌模型则发现, 该方可抑制Bcl-2基因表达, 而促进Fas基因表达, 使胃黏膜细胞发生正常凋亡, 逆转或阻止胃癌发生. 紫杉醇在诱导胃癌细胞凋亡的同时可使端粒酶的活性下降, 而且呈时间依赖性和剂量依赖性[29]. 姜黄素诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡的作用也呈现出时间依赖性和剂量依赖性[30]. 人参挥发油可抑制体外培养的SGC-823胃癌细胞糖代谢和能量代谢, 进而抑制核酸代谢抑制胃癌的生长[31]. 目前在研究的药物还有大蒜油[32], 甘草提取物、虫草、黄今提取物、海浮石中的硅酸盐、水蛭、丹参、没食子丙酸、砒霜等[33-34]. 我们先前的实验结果表明, 中药胃康宁示仅可抑制胃癌的生长, 还能抑制胃癌组织中P53, VEGF等的表达[35-36]. 本实验的结果表明, 体外培养的各用药组胃癌细胞VEGF及其受体KDR、Flt免疫组化检测图像的灰度值均增加, 与对照组比较差异具有显著性(P <0.01), 而各用药组VEGF及其受体KDR、Flt mRNA的表达则减弱(P <0.01), 说明胃康宁对VEGF及其受体KDR、Flt基因的表达具有明显的抑制作用, 并存在一定的量效关系. 同时也说明了中药对胃癌的治疗作用是多靶点、多层次的, 既作用于相关的基因, 又作用于相应的蛋白和受体.

编辑: N/A

1.  Maehara Y, Kakeji Y, Oda S, Baba H, Sugimachi K. Tumor growth patterns and biological characteristics of early gastric carcinoma. Oncology. 2001;61:102-112.  [PubMed]  [DOI]
2.  Ohta M, Kitadai Y, Tanaka S, Yoshihara M, Yasui W, Mukaida N, Haruma K, Chayama K. Monocyte chemoattractant protein-1 expression correlates with macrophage infiltration and tumor vascularity in human gastric carcinomas. Int J Oncol. 2003;22:773-778.  [PubMed]  [DOI]
3.  Keyes KA, Mann L, Cox K, Treadway P, Iversen P, Chen YF, Teicher BA. Circulating angiogenic growth factor levels in mice bearing human tumors using Luminex Multiplex technology. Cancer Chemother Pharmacol. 2003;51:321-327.  [PubMed]  [DOI]
4.  Duff SE, Li C, Jeziorska M, Kumar S, Saunders MP, Sherlock D, O'Dwyer ST, Jayson GC. Vascular endothelial growth factors C and D and lymphangiogenesis in gastrointestinal tract malignancy. Br J Cancer. 2003;89:426-430.  [PubMed]  [DOI]
5.  Etoh T, Inoue H, Tanaka S, Barnard GF, Kitano S, Mori M. Angiopoietin-2 is related to tumor angiogenesis in gastric carcinoma: possible in vivo regulation via induction of proteases. Cancer Res. 2001;61:2145-2153.  [PubMed]  [DOI]
6.  Ikeguchi M, Cai J, Fukuda K, Oka S, Katano K, Tsujitani S, Maeta M, Kaibara N. Correlation between spontaneous apoptosis and the expression of angiogenic factors in advanced gastric adenocarcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2001;20:257-263.  [PubMed]  [DOI]
7.  Huang SP, Wu MS, Wang HP, Yang CS, Kuo ML, Lin JT. Correlation between serum levels of interleukin-6 and vascular endothelial growth factor in gastric carcinoma. J Gastroenterol Hepatol. 2002;17:1165-1169.  [PubMed]  [DOI]
8.  Liu DH, Zhang XY, Fan DM, Huang YX, Zhang JS, Huang WQ, Zhang YQ, Huang QS, Ma WY, Chai YB. Expression of vascular endothelial growth factor and its role in oncogenesis of human gastric carcinoma. World J Gastroenterol. 2001;7:500-505.  [PubMed]  [DOI]
9.  Tao HQ, Lin YZ, Wang RN. Significance of vascular endothelial growth factor messenger RNA expression in gastric cancer. World J Gastroenterol. 1998;4:10-13.  [PubMed]  [DOI]
10.  Zhang H, Wu J, Meng L, Shou CC. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors KDR and Flt-1 in gastric cancer cells. World J Gastroenterol. 2002;8:994-998.  [PubMed]  [DOI]
11.  Ren J, Dong L, Xu CB, Pan BR. The role of KDR in the interactions between human gastric carcinoma cell and vascular endothelial cell. World J Gastroenterol. 2002;8:596-601.  [PubMed]  [DOI]
12.  Song ZJ, Gong P, Wu YE. Relationship between the expression of iNOS,VEGF,tumor angiogenesis and gastric cancer. World J Gastroenterol. 2002;8:591-595.  [PubMed]  [DOI]
13.  Fabbri C, Jaboli MF, Giovanelli S, Azzaroli F, Pezzoli A, Accogli E, Liva S, Nigro G, Miracolo A, Festi D. Gastric autoimmune disorders in patients with chronic hepatitis C before, during and after interferon-alpha therapy. World J Gastroenterol. 2003;9:1487-1490.  [PubMed]  [DOI]
14.  Amioka T, Kitadai Y, Tanaka S, Haruma K, Yoshihara M, Yasui W, Chayama K. Vascular endothelial growth factor-C expression predicts lymph node metastasis of human gastric carcinomas invading the submucosa. Eur J Cancer. 2002;38:1413-1419.  [PubMed]  [DOI]
15.  Takahashi A, Kono K, Itakura J, Amemiya H, Feng Tang R, Iizuka H, Fujii H, Matsumoto Y. Correlation of vascular endothelial growth factor-C expression with tumor-infiltrating dendritic cells in gastric cancer. Oncology. 2002;62:121-127.  [PubMed]  [DOI]
16.  Ishikawa M, Kitayama J, Kazama S, Nagawa H. Expression of vascular endothelial growth factor C and D (VEGF-C and -D) is an important risk factor for lymphatic metastasis in undifferentiated early gastric carcinoma. Jpn J Clin Oncol. 2003;33:21-27.  [PubMed]  [DOI]
17.  Kaneko T, Konno H, Baba M, Tanaka T, Nakamura S. Urokinase-type plasminogen activator expression correlates with tumor angiogenesis and poor outcome in gastric cancer. Cancer Sci. 2003;94:43-49.  [PubMed]  [DOI]
18.  Shi H, Xu JM, Hu NZ, Xie HJ. Prognostic significance of expression of cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor in human gastric carcinoma. World J Gastroenterol. 2003;9:1421-1426.  [PubMed]  [DOI]
19.  Kimura H, Konishi K, Nukui T, Kaji M, Maeda K, Yabushita K, Tsuji M, Miwa A. Prognostic significance of expression of thymidine phosphorylase and vascular endothelial growth factor in human gastric carcinoma. J Surg Oncol. 2001;76:31-36.  [PubMed]  [DOI]
20.  Li HH, Wang XC, Lu JR, He KJ, Yang Z. Effects of short-term treatment of somatostatin on angiogenesis of gastric carcinoma. Ai Zheng. 2003;22:990-993.  [PubMed]  [DOI]
21.  Basaki Y, Chikahisa L, Aoyagi K, Miyadera K, Yonekura K, Hashimoto A, Okabe S, Wierzba K, Yamada Y. Gamma-Hydroxybutyric acid and 5-fluorouracil, metabolites of UFT, inhibit the angiogenesis induced by vascular endothelial growth factor. Angiogenesis. 2001;4:163-173.  [PubMed]  [DOI]
22.  Keyes KA, Mann L, Cox K, Treadway P, Iversen P, Chen YF, Teicher BA. Circulating angiogenic growth factor levels in mice bearing human tumors using Luminex Multiplex technology. Cancer Chemother Pharmacol. 2003;51:321-327.  [PubMed]  [DOI]
23.  Tian X, Song S, Wu J, Meng L, Dong Z, Shou C. Vascular endothelial growth factor: acting as an autocrine growth factor for human gastric adenocarcinoma cell MGC803. Biochem Biophys Res Commun. 2001;286:505-512.  [PubMed]  [DOI]
24.  Broggini M, Marchini SV, Galliera E, Borsotti P, Taraboletti G, Erba E, Sironi M, Jimeno J, Faircloth GT, Giavazzi R. Aplidine, a new anticancer agent of marine origin, inhibits vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion and blocks VEGF-VEGFR-1 (flt-1) autocrine loop in human leukemia cells MOLT-4. Leukemia. 2003;17:52-59.  [PubMed]  [DOI]
25.  Penault-Llorca F, Etessami A, Bourhis J. Principal therapeutic uses of monoclonal antibodies in oncology. Cancer Radiother. 2002;6:24s-28s.  [PubMed]  [DOI]
26.  赵 群, 李 勇, 王 力利. 参芪扶正注射液对胃癌患者手术及化疗时免疫功能的影响. 中国中西医结合杂志. 2001;21:424-426.  [PubMed]  [DOI]
27.  单 兆伟, 陆 为民. 胃舒胶囊治疗萎缩性胃炎癌前病变气虚血瘀证临床与实验研究. 中医杂志. 2001;42:539-542.  [PubMed]  [DOI]
28.  崔 儒涛, 程 勇. 乐胃煎对大鼠胃黏膜上皮异型增生细胞凋亡及调控基因的影响. 中西医结合脾胃杂志. 2000;8:67-69.  [PubMed]  [DOI]
29.  朱 菊人, 刘 吉勇, 许 洪伟. 紫杉醇诱导胃癌细胞凋亡及对端粒酶活性调节的关系. 临床消化病杂志. 2001;13:243-245.  [PubMed]  [DOI]
30.  叶 红军, 吴 运, 房 家智. 刺五加皂甙对胃癌细胞膜电位和亚细胞结构的影响. 中华消化杂志. 2002;22:48-49.  [PubMed]  [DOI]
31.  赵 军宁, 王 晓东, 彭 晓华. 姜黄素诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡. 中药药理与临床. 2000;16:12-13.  [PubMed]  [DOI]
32.  王 懑霞, 李 凤文, 李 晓光. 人参挥发油对体外培养SGC-823胃癌细胞化学成分的影响. 中国中药杂志. 1992;17:110-112.  [PubMed]  [DOI]
33.  李 晓光, 谢 锦玉, 李 文梅. 大蒜油诱导人胃癌细胞分化和凋亡的机制研究. 中华肿瘤杂志. 1998;20:325.  [PubMed]  [DOI]
34.  马 靖, 彭 文烈, 梁 东. 甘草提取物诱导胃癌MGC-803细胞凋亡的初步研究. 中国中西医结合杂志. 2000;20:928.  [PubMed]  [DOI]
35.  李 庆明, 余 谦, 曾 敬, 吴 伟康. 胃康宁对大鼠胃癌VEGF表达的影响. 世界华人消化杂志. 2000;8:359-360.  [PubMed]  [DOI]
36.  李 庆明, 余 谦, 闵 存云. P53突变与VEGF在大鼠胃癌中的表达及中药胃康宁的防治作用. 世界华人消化杂志. 2003;11:997-1000.  [PubMed]  [DOI]