胃癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-03-15; 12(3): 530-532
在线出版日期: 2004-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i3.530
TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响
胡忠良, 文继舫, 柳洋, 王宽松, 郑晖, 傅春燕
胡忠良, 文继舫, 柳洋, 王宽松, 郑晖, 傅春燕, 中南大学基础医学院病理学教研室 湖南省长沙市 410078
胡忠良, 男, 1973-02-05生, 湖南省衡山县人, 汉族. 1997年湖南医科大学学士, 中南大学基础医学院病理学教研室在职博士生, 主要从事胃肠肿瘤研究.
通讯作者: 文继舫, 410078, 湖南省长沙市湘雅路88号, 中南大学基础医学院病理学教研室. jifangwen@hotmail.com
电话: 0731-2650400 传真: 0731-2650400
收稿日期: 2003-07-15
修回日期: 2003-08-06
接受日期: 2003-08-28
在线出版日期: 2004-03-15

目的: TGIF(TG interacting factor)是TGF-β和视黄醛信号传导通路的抑制分子, 且MAPK通路的活化能延长其半衰期, 但他在肿瘤发生中的作用尚不清楚, 本研究旨在探讨TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响.

方法: 将TGIF反义寡核酸瞬时转染胃癌细胞株SGC-7901, RT-PCR检测转染效率, MTT法检测胃癌细胞的增生速度, 流式细胞术分析转染细胞的细胞周期和凋亡率的变化.

结果: SGC-7901细胞转染TGIF反义寡核苷酸后, 细胞增生受到部分抑制, 72 h后, 他的抑制率达20.4%, 但细胞的凋亡和细胞周期分布无明显改变. TGF-β1处理后, 与突变寡核苷酸转染组细胞和未转染组细胞相比, TGIF反义寡核苷酸转染的SGC-7901细胞的增生受到明显抑制(30%), G1期细胞含量增加更明显.

结论: TGIF能抑制TGF-β1对细胞生长和细胞周期的负调控作用, 多数肿瘤细胞和间质细胞能分泌TGF-β1, 这些肿瘤细胞有可能利用TGIF甚至少量TGIF, 抑制TGF-β对自身的生长抑制作用, 从而促进肿瘤的发生、发展与转移.

关键词: N/A
引文著录: 胡忠良, 文继舫, 柳洋, 王宽松, 郑晖, 傅春燕. TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(3): 530-532
Effects of TGIF antisense oligonucleotide on proliferation and apoptosis of gastric carcinoma cells
Zhong-Liang Hu, Ji-Fang Wen, Yang Liu, Kuan-Song Wang, Hui Zhen, Chun-Yan Fu
Zhong-Liang Hu, Ji-Fang Wen, Yang Liu, Kuan-Song Wang, Hui Zhen, Chun-Yan Fu, Department of Pathology, Basic Medical Institute, Central South University, Changsha 410078, Hunan Province, China
Correspondence to: Ji-Fang Wen, Department of Pathology, Basic Medical Institute, Central South University, 88 Xiangya Road, Changsha 410078, Hunan Province, China. jifangwen@hotmail.com
Received: July 15, 2003
Revised: August 6, 2003
Accepted: August 28, 2003
Published online: March 15, 2004

AIM: TG interacting factor(TGIF) can inhibit both TGF-β and retinoid signaling pathways, moreover, the activation of MAPK pathway can lengthen its half life. However, its role in carcinogenesis is still unclear. Thus we attempt to investigate the effect of TGIF antisense oligodeoxynucleo-tide(ASDON) on proliferation and apoptosis of gastric carcinoma cells.

METHODS: After gastric carcinoma cells, SGC-7901, were transfected with TGIF ASDON, we analyzed the transfect efficiency by RT-PCR, its proliferation by MTT method, cell cycle and apoptosis rate via flow cytometer.

RESULTS: After transfection with TGIF ASDON, the proliferation of SGC-7901 cells was partially inhibited, and its inhibitory rate was increased to 20.4% at 72 h, whereas it had no effect on cell cycle and apoptosis of SGC-7901 cells. Followed by the treatment of TGF-β1, the growth rate of cells transfected with TGIF ASDON was distinctly reduced by 30%, and the content of G1 phase cells increased more obviously compared with the cells transfected with mutated oligonucleotides or untransfected cells.

CONCLUSION: TGIF can resist the negative regulation of TGF-β1 over proliferation and cell cycle. Most of tumor cells and interstitial cells can secrete TGF-β1, and tumor cells may resist the TGF-β1 mediated growth inhibition via TGIF, leading to the progression and even metastasis of tumor.

Key Words: N/A
0 引言

胃癌是一种严重威胁我国人民生命健康的常见肿瘤, 但其确切的发病机制尚不清楚[1-8]. 目前国内外的研究均表明, 多数肿瘤丧失了TGF-β介导的生长抑制作用, 胃癌也不例外[9]. TGIF(TG-interacting factor, TGIF)能抑制TGF-β信号通路[10-13]. MAPK通路与TGF-β信号传导通路间存在对话, MAPK通路对TGIF的磷酸化使TGIF的半衰期延长, TGIF蛋白浓度升高[14]; 且c-Jun能增强TGIF与smad2的结合[15]. TGIF功能的增强可能抑制TGF-β对细胞的负性调节作用. 为探讨TGIF在肿瘤发生中的作用, 我们利用TGIF反义寡核苷酸转染胃癌细胞SGC-7901, 观察他对该细胞增生和凋亡的影响.

1 材料和方法
1.1 材料

胃癌细胞系SGC-7901购自中国科学院上海细胞库, TGF-β1购自Sigma公司, TGIF反义寡核苷酸和突变寡核苷酸参照文献(Wotton D, et al, Cell 1999; 97: 29-39)由上海生物工程技术服务有限公司合成, 各碱基均用硫代磷酸化法修饰. 脂质体Lipofectin, Trizol和RPMI 1640购自Invitrogen公司. 超级小牛血清购自杭州四季青公司, RT-PCR试剂盒购自Promega公司, TGIF和-actin扩增引物(表1)由软件Primer Premier 5.0设计, 由上海生物工程技术服务有限公司合成.

表1 TGIF和-actin的扩增引物序列.
引物序列长度(bp)
TGIF上游 5'-GAGAAGGAGAAGGGGCAACCTA-3'420
下游 5'-TGGCAGATCACTGATGGACG-3'
β-actin上游 5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3'204
下游 5'- GGAGCAATGATCTTGATCTT -3'
1.2 方法

将细胞接种于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液中, 在含50 mL/L CO2空气的饱和湿度培养箱37℃连续培养. 实验用细胞均处于对数生长期. TGIF反义寡核苷酸转染前1 d, 接种SGC-7901细胞至96孔板中(3×103个/孔)或50 mL培养瓶中(5×105个/瓶)贴壁培养18 h, 无血清培基洗涤细胞2次, 转染按lipofectin说明书进行, 最终每孔或每瓶分别转染0.5或5 g寡核苷酸, 实验共分3组, 即TGIF反义寡核苷酸转染组、突变寡核苷酸转染组和未转染组. 转染6 h后, 弃转染液. 无血清培基洗涤细胞2次, 各组细胞换用正常培养液或含TGF-β1(10 g/L)的培养液继续培养. 按TRIzol说明书提取总RNA, 琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的提取质量, 核酸分析仪测定RNA含量, 2 g总RNA按逆转录试剂盒说明书合成cDNA第一链. 再取cDNA 2 L进行PCR扩增, PCR反应体系: 亚沸水35.5 L, 10×buffer 5 L , MgCl2 4 L(25 mmol/L), dNTP 1 L(200 mol/L), 引物各1 L(0.1 mol/L), Taq酶0.5 L(2 Mu/L), 混匀后加入50 L矿物油, 点离心. 95 ℃变性10 min, 扩增35个循环(97 ℃ 50 s, 62 ℃ 90 s, 72 ℃ 90 s), 第5循环结束后, 加-actin引物(0.1 mol/L) 1 L继续扩增, 最后延伸10 min. MTT法检测细胞的增生速度换用正常培养液或含TGF-β1(10 g/L)的培养液培养24 h、48 h和72 h后, 加5 g/L的MTT 20 L于各组中(4孔/组), 继续培养4 h后弃板中的培养液, 各孔加DMSO 150 L, 轻轻振动后用酶标仪(波长490 nm)测定各孔的A值. 流式细胞术分析细胞周期和凋亡 在换用正常培养液或含TGF-β1(10 g/L)的培养液培养48 h后, 0.2 g/L EDTA和2.5 g/L胰酶消化并收集细胞, PBS洗涤2次, 750 mL/L乙醇4 ℃固定, 流式细胞仪测定各组细胞的DNA含量, Cell Quest软件分析细胞群体的周期分布和凋亡.

2 结果
2.1 TGIF反义寡核苷酸转染对TGIF表达的影响

经RT-PCR分析发现SGC-7901细胞转染TGIF反义寡核苷酸后, TGIF mRNA表达明显减少(图1), TGIF反义寡核苷酸能抑制TGIF的表达.

图1
图1 TGIF反义寡核苷酸转染SGC-7901细胞24 h后RT-PCR分析. 1: TGIF反义寡核苷酸; 2: 突变寡核苷酸; 3: 阴性对照; 前带-actin,204 bp; 后带TGIF, 420 bp.
2.2 TGIF反义寡核苷酸对SGC-7901细胞生长的影响

TGIF反义寡核苷酸转染细胞后, SGC-7901细胞24和48 h的生长速度出现一定程度的抑制, 72 h后, TGIF反义寡核苷酸转染细胞的生长抑制率达20.4%(较未转染细胞)(图2). TGF-β1处理后, 各组细胞生长速度均明显减慢(图3), 且TGIF反义寡核苷酸转染细胞的生长速度较突变组和未转染组明显减慢, 72 h后, TGIF反义寡核苷酸转染细胞的生长抑制率达30%(较未转染细胞).

图2
图2 TGIF反义寡核甘酸对SGC-7901细胞生长的影响.
图3
图3 TGF-β1处理后, TGIF反义寡核苷酸对SGC-7901细胞生长的影响.
2.3 TGIF反义寡核苷酸对SGC-7901细胞周期的影响

TGIF反义寡核苷酸转染后, 流式细胞术分析3组细胞的细胞周期分布未见明显差别(表2); TGF-β1处理后, TGIF反义寡核苷酸转染组的G1期细胞含量由49%增加到58%, 较未转染组和突变寡核苷酸转染组的G1期细胞含量增加更明显.

表2 TGIF反义寡核苷酸对细胞周期的影响.
反义TGIF转染组
突变寡核苷酸转染组
未转染组
TGF-β1(+)TGF-β1(-)TGF-β1(+)TGF-β1(-)TGF-β1(+)TGF-β1(-)
G10.580.490.530.470.560.49
G20.080.110.90.140.080.13
S0.340.400.380.390.360.39
2.4 TGIF反义寡核苷酸对SGC-7901细胞凋亡的影响

TGIF反义寡核苷酸转染组与突变寡核苷酸转染组和未转染组3组间细胞凋亡率未见明显差别; TGF-β1处理后, 各组细胞的凋亡率无明显差别.

3 讨论

众所周知, TGF-β是一类能抑制上皮细胞生长的细胞因子, 肿瘤细胞常常逃逸TGF-β介导的生长抑制作用. TGIF是TGF-β和视黄醛[16]信号传导通路的抑制分子, Nakakuki et al[17]发现在食管癌细胞系中有TGIF基因的扩增, Luo et al[18]发现在卵巢癌患者的血清中存在针对TGIF的抗体. 他在肿瘤中的作用引起了我们的极大兴趣. 我们推测TGIF反义寡核苷酸可能通过拮抗TGIF对TGF-β和视黄醛信号传导通路的抑制作用, 从而部分逆转胃癌细胞的生物学行为. 但TGIF反义寡核苷酸转染SGC-7901细胞后, 他的生长速度无明显减慢, 细胞周期分布也无明显改变, 这可能是由于SGC-7901细胞在缺乏外源性TGF-β1时, TGF-β信号通路处于未激活状态所致. 他同时提示我们反义TGIF可能不能逆转胃癌细胞的恶性生长特点.

TGF-β1作用后, TGIF反义寡核苷酸组细胞较突变组和未转染组细胞的生长速度明显减慢, 流式细胞术分析也表明TGIF反义寡核苷酸转染细胞的G1期细胞的含量较突变寡核苷酸组和未转染组明显增多. Lo et al[14]的研究报道与我们的结果一致, 他利用碘化脱氧尿嘧啶吸收试验, 发现稳定转染TGIF基因的HaCaT细胞能拮抗TGF-β介导的生长抑制作用.

乔文 et al[19]发现TGF-β1能明显诱导SGC-7901细胞的凋亡, 但我们多次流式细胞分析均表明TGF-β1不能明显诱导SGC-7901细胞的凋亡. TGIF反义寡核苷酸转染后, 胃癌细胞的凋亡没有明显改变; TGF-β1作用后, 他的凋亡率也无明显改变. 这很可能是由于SGC-7901细胞本身对TGF-β1介导的细胞凋亡不敏感, 导致TGIF反义寡核苷酸不能通过拮抗TGIF而增强TGF-β对该细胞的凋亡诱导作用. TGIF是否能抑制TGF-β诱导的细胞凋亡作用有待进一步的研究.

因此, 我们在胃癌细胞SGC-7901中证明TGIF不能抑制他的增生和诱导他的凋亡, 但能抑制TGF-β对该细胞生长和细胞周期的负调控作用, 最近, Chen et al[20]发现TGF-β能诱导TGIF mRNA表达上调. 有趣的是: 多数肿瘤细胞和间质细胞能分泌TGF-β, 这些肿瘤细胞有可能利用TGIF甚至少量TGIF, 抑制TGF-β对自身的生长抑制作用, 从而促进肿瘤的发生与发展, 甚至导致肿瘤的转移.

编辑: N/A

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