塞莱西布体外对人类肝胃癌细胞生长的抑制作用

摘要

目的: 研究塞莱西布在体外对人类肝癌7721细胞以及胃癌7901细胞的生长抑制作用.

方法: 两种肿瘤细胞用含不同浓度(0, 20, 40, 80, 160和320 mmol/L)的塞莱西布的培养液培养. 应用MTT测定法来测定生长抑制率, 电镜技术来观察细胞凋亡情况, 免疫组化技术来检测细胞内Cox-2蛋白含量.

结果: 塞莱西布对两种肿瘤细胞均具有生长抑制作用(塞莱西布320 mmol/L时两种肿瘤细胞抑制率分别为49.1%和42.9%), 并呈现量-效关系. 电镜下可观察到凋亡细胞. 免疫组化发现细胞内环氧化酶的含量在处理前后有明显变化.

结论: 在体外, 塞莱西布抑制人类肝癌及胃癌细胞生长, 诱导他们产生凋亡, 并且该作用与细胞内环氧化酶含量有密切关系.

关键词: N/A

Inhibitory effects of celecoxib on proliferation of human liver and gastric carcinoma cells in vitro

Jing Fan, Ke-Feng Dou, Kai-Zong Li

Jing Fan, Ke-Feng Dou, Kai-Zong Li, Department of Hepatobiliary Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China

Correspondence to: Jing Fan, Department of Hepatobiliary Surgery,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, 127 Changle West Road, Xi'an 710032, Shanxi Province, China.fanjing@fmmu.edu.cn

Received: January 2, 2004
Revised: January 6, 2004
Accepted: January 12, 2004
Published online: March 15, 2004

Abstract

AIM: To study the inhibitory effects of celecoxib on proliferation of human hepatoma SMMC-7721 cells and gastric cancer SGC-7901 cells in vitro.

METHODS: The two carcinoma cells were cultured with celecoxib at various concentrations(0, 20, 40, 80, 160 and 320 mmol/L). Growth suppression was detected with MTT colorimetric assay, cell apoptotic alterations were evaluated by transmission electron microscopy(TEM), and quantity of Cox-2 was evaluated by cytochemical staining.

RESULTS: The inhibition of proliferation on two carcinoma cells was observed(49.1% and 42.9% by 320 mmol/L celecoxib). The inhibitory effect was dose-dependent. Apoptotic cells were observed under transmission electron microscope. The different quantities of Cox-2 protein in cells were observed by cytochemical staining.

CONCLUSION: Celecoxib inhibits proliferation, induces apoptosis of human two carcinoma cells in vitro, and the effects have close relation to the quantities of Cox-2 protein in cells.

Key Words: N/A

0 引言

早在1870年代, 阿斯匹林以及其衍生物就被用于解热、镇痛以及抗血栓的治疗[1]. 他们被称作非甾体类抗炎药(NSAID), 其主要的作用在于抑制了环氧化酶(cyclooxygenase)的活性, 减少了前列腺素的合成, 从而降低了炎症反应. 最近, 通过流行病学、基础实验和临床研究发现, 长期服用NSAID可以降低食管癌、胃癌、结肠癌及直肠癌等肿瘤的发病率. 其中, 针对环氧化酶两种亚型之一的环氧化酶-2(Cox-2)的特异性抑制剂塞莱西布(celecoxib)具有明显的抑制多种肿瘤细胞如前列腺癌[2]、脑瘤[3]等的生长, 并有促进肿瘤细胞凋亡的作用. 因此, 我们选择人类肝癌细胞(SMMC-7721)和胃癌细胞(SGC-7901)来观察塞莱西布对他们的生长抑制及促凋亡作用, 为塞莱西布抗肿瘤机制的进一步研究和肿瘤的化学治疗或是化学辅助治疗的临床应用提供依据.

1 材料和方法

1.1 材料

Celecoxib购自Cearal公司, -20 ℃保存. 胰酶购自华美生物公司. MTT购自Gibco公司. Cox-2免疫组化试剂盒购自博士德生物公司. 小牛血清、RPMI1640和DMSO购自鼎国公司. 肝癌细胞(SMMC-7721)由本实验室提供, 细胞置于含50 mL/L CO₂ 37℃的培养箱中培养, 以含100 mL/L小牛血清的RPMI1640作为其培养基, 104/L细胞接种100 mL培养瓶进行培养, 3 d传代.

1.2 方法

将对数生长期的SMMC-7721及SGC-7901细胞记数后, 调整细胞密度为1×10⁴/L, 接种到96孔培养板, 每孔200 L, 每组8孔, 细胞贴壁后每孔分别加入20, 40, 80, 160和320 mol/L不同浓度的塞莱西布继续培养24 h, 以培养液为对照组. 分别加入新配置的5 g/L MTT 60 L, 37℃继续孵育4h, 弃上清, 加入DMSO 150 L以及甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.2) 20 L, 振荡10 min后, 用酶标仪, 在570 nm波长测定吸光度, 记录数据. 肿瘤细胞的抑制率(%) =(1-实验组A值/阴性对照组A值)×100%. 细胞培养同上, 对照组换正常培养液, 实验组换含320 mol/L的塞莱西布的培养液, 培养24h后, 消化后D-Hanks液洗涤离心(1 000 r/min, 5min/次) 2次后, 用25 g/L戊二醛4℃固定30 min, 常规制作电镜标本, 双铅染色后, 置于1200EX型透射电镜观察摄片. 细胞以10⁴/L分别接种4个预置4块1cm×1cm盖玻片的6 cm培养皿, 37 ℃培养箱培养, 设立对照组和实验组, 对照组换正常培养液, 实验组换含320 mol/L的塞莱西布的培养液, 培养24 h后, 按试剂盒说明固定染色, 显微镜(Olypus)观察摄片.

统计学处理 对MTT测定所获得的数据进行mean±SD检验分析, P<0.05被认为是有显著差异.

2 结果

2.1 MTT法检测

随着药物浓度的升高, 两种细胞的存活率呈明显下降, 存在量效关系(表1).

表1 莱西布对肿瘤细胞增生活性的影响(MTT法mean±SD).

塞莱西布(mmol/L)	A值		抑制率(%)		t
	SGC-7901	SMMC-7721	SGC-7901	SMMC-7721	SGC-7901	SMMC-7721
0 (对照)	0.0 743±0.0 024	0.0 653±0.0 021
20	0.0 703±0.0 012	0.0 607±0.0 006	5.4±1.2	7.7±0.7	6.000	13.999
40	0.0 697±0.0 012	0.0 593±0.0 021	6.3±1.2	9.2±2.4	7.000	4.992
80	0.0 680±0.0 020	0.0 587±0.0 015	8.5±1.8	10.2±1.7	5.485	7.559
160	0.0 557±0.0 042	0.0 503±0.0 015	25.0±4.0	23.0±1.7	7.766	17.008
320	0.0 393±0.0 050	0.0 373±0.0 012	47.1±4.8	42.9±1.4	12.044	41.999

P < 0.05.

2.2凋亡细胞的超微结构

在电镜下可以看出, 两种实验组的细胞, 有典型的凋亡结构出现. 其特征是细胞皱缩, 微绒毛消失, 体积缩小, 且染色质浓缩, 形成沿核膜分布的不同形状和大小的块状结构(图1).

图1 癌细胞凋亡的超微结构电镜×12 000. A: 7901细胞; B: 7721细胞.

2.3 细胞化学染色观察

COX-2阳性的细胞主要为细胞质和核膜着色, 呈棕黄色细颗粒状, 少部分细胞有细胞核和细胞质同时着色. 处理前的两种肿瘤细胞, COX-2的表达水平较高, 而处理后, 可以发现, COX-2表达水平明显下降, 并出现细胞形态的改变(图2).

图2 塞莱西布作用24 h的COX-2表达SABC×400. A1: 7901对照组; A2: 7901实验组; B1: 7721对照组; B2: 7721实验组.

3 讨论

Kerr et al学者最先提出了细胞凋亡这个概念. 随后的一系列研究显示肿瘤细胞的增生与其丧失凋亡能力有关[4-17], 并且存在多种因素导致了肿瘤细胞凋亡能力的丧失[18-23]. 因此, 探索能够诱导肿瘤细胞凋亡的新药就成为了众多学者努力的方向[24-25]. 作为一种新近合成的抗风湿的非甾体类抗炎药, 塞莱西布最初的目的主要是抗炎镇痛治疗. 然而, 随着一些临床流行病学的调查的展开, 有学者发现, 患有家族性腺瘤息肉病的患者, 在持续6 mo服用一定剂量的塞莱西布后, 其息肉数量和大小都小于对照组患者[26]. 流行病学研究的发现, 引起了科研人员的注意. 随后展开的一些实验中, 人们发现, 塞莱西布能够抑制部分肿瘤细胞的生长并且诱导他们的凋亡, 比如: 前列腺癌[2]、脑癌[3]等.

目前肿瘤仍是严重威胁人类生命的主要疾病之一, 其发病机制复杂, 影响因素多[27-30]. 临床上, 许多患者在确诊时已丧失了手术机会, 而化疗和放疗的效果不佳、毒副作用较大. 因此, 寻找一种高效低毒的药物作为化疗治疗或是辅助治疗晚期肿瘤就是许多学者研究的方向. 本实验中, 我们通过MTT法, 发现塞莱西布具有明显的抑制两种肿瘤细胞生长的作用, 并且存在量-效关系. 通过电镜等, 我们又观察到塞莱西布对他们存在明显的促凋亡作用. 通过细胞化学染色, 我们发现, 塞莱西布对两种肿瘤细胞内的环氧化酶-2(Cox-2)具有明显的抑制作用, 此酶的含量可能与塞莱西布的作用密切相关.

目前, 塞莱西布抑制肿瘤细胞生长和促进其凋亡的作用机制还不是很清楚, 存在几种不同的观点. 有的观点认为, 环氧化酶-2(Cox-2)在肿瘤组织过表达所产生的前列腺素E2, 是大部分肿瘤细胞形成和存活的基础, 塞莱西布抑制了他的表达, 也同时抑制了前列腺素E2的合成, 因此抑制了肿瘤细胞的存活, 诱导了凋亡[3]; 有的观点认为, 塞莱西布抑制了肿瘤细胞内内质网表面的Ca²⁺依赖的ATP酶的功能, 导致了细胞内Ca²⁺调控机制的紊乱, 从而促进了肿瘤细胞的凋亡[31]; 还有观点认为, 塞莱西布通过抑制了蛋白激酶依赖的激酶1(PDK1)的磷酸化, 抑制了该激酶的功能, 也抑制了其下游分子蛋白激酶B(PKB)的功能, 从而导致了有功能的促凋亡分子bad在细胞内的表达量上升, 促进了细胞凋亡等[32].

最近, 塞莱西布已经被美国食品和药品管理委员会(FDA)批准, 作为患家族性息肉病(FAP)的患者预防结肠癌的预防药物. 相信随着科研实验的进一步深入, 对环氧化酶-2的特异性抑制剂塞莱西布抗肿瘤的作用机制的研究必将有所突破. 塞莱西布所具有的明显的抑制肿瘤细胞生长并且诱导其凋亡的特性, 相信将在多种晚期肿瘤的化疗治疗或辅助治疗中具有广阔的应用前景.

备注

编辑: N/A

参考文献

1.	Vane JR, Botting RM. The mechanism of action of aspirin. Thromb Res. 2003;110:255-258.  [PubMed]  [DOI]

2.	Kirschenbaum A, Liu X, Yao S, Levine AC. The role of cyclooxygenase-2 in prostate cancer. Urology. 2001;58:127-131.  [PubMed]  [DOI]

3.	Patti R, Gumired K, Reddanna P, Sutton LN, Phillips PC, Reddy CD. Overexpression of cyclooxygenase-2(COX-2) in human primitive neuroectodermal tumors: effect of celecoxib and rofecoxib. Cancer Lett. 2002;180:13-21.  [PubMed]  [DOI]

4.	Tian G, Yu JP, Luo HS, Yu BP, Yue H, Li JY, Mei Q. Effect of nimesulide on proliferation and apoptosis of human hepatoma SMMC-7721 cells. World J Gastroenterol. 2002;8:483-487.  [PubMed]  [DOI]

5.	Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8:385-392.  [PubMed]  [DOI]

6.	Tao HQ, Zou SC. Effect of preoperative regional artery chemotherapy on proliferation and apoptosis of gastric carcinoma cells. World J Gastroenterol. 2002;8:451-454.  [PubMed]  [DOI]

7.	Liu S, Wu Q, Ye XF, Cai JH, Huang ZW, Su WJ. Induction of apoptosis by TPA and VP-16 is through translocation of TR3. World J Gastroenterol. 2002;8:446-450.  [PubMed]  [DOI]

8.	Shigeno M, Nakao K, Ichikawa T, Suzuki K, Kawakami A, Abiru S, Miyazoe S, Nakagawa Y, Ishikawa H, Hamasaki K. Interferon-alpha sensitizes human hepatoma cells to TRAIL-induced apoptosis through DR5 upregulation and NF-kappaB inactivation. Oncogene. 2003;22:1653-1662.  [PubMed]  [DOI]

9.	Shen ZY, Shen J, Li QS, Chen CY, Chen JY, Yi Z. Morphological and functional changes of mitochondria in apoptotic esophageal carcinoma cells induced by arsenic trioxide. World J Gastroenterol. 2002;8:31-35.  [PubMed]  [DOI]

10.	Shen ZY, Shen WY, Chen MH, Shen J, Cai WJ, Yi Z. Nitric oxide and calcium ions in apoptotic esophageal carcinoma cells induced by arsenite. World J Gastroenterol. 2002;8:40-43.  [PubMed]  [DOI]

11.	Wu YL, Sun B, Zhang XJ, Wang SN, He HY, Qiao MM, Zhong J, Xu JY. Growth inhibition and apoptosis induction of Sulindac on Human gastric cancer cells. World J Gastroenterol. 2001;7:796-800.  [PubMed]  [DOI]

12.	Sun BH, Zhao XP, Wang BJ, Yang DL, Hao LJ. FADD and TRADD expression and apoptosis in primary hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2000;6:223-227.  [PubMed]  [DOI]

13.	Shan CM, Li J. Study of apoptosis in human liver cancers. World J Gastroenterol. 2002;8:247-252.  [PubMed]  [DOI]

14.	Liu LX, Jiang HC, Piao DX. Radiofrequence ablation of liver cancers. World J Gastroenterol. 2002;8:393-399.  [PubMed]  [DOI]

15.	Wang FS, Liu MX, Zhang B, Shi M, Lei ZY, Sun WB, Du QY, Chen JM. Antitumor activities of human autologous cytokineinduced killer(CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo. World J Gastroenterol. 2002;8:464-468.  [PubMed]  [DOI]

16.	Yang JY, Luo HY, Lin QY, Liu ZM, Yan LN, Lin P, Zhang J, Lei S. Subcellular daunorubicin distribution and its relation to multidrug resistance phenotype in drug-resistant cell line SMMC-7721/R. World J Gastroenterol. 2002;8:644-649.  [PubMed]  [DOI]

17.	Huang J, Cai MY, Wei DP. HLA class I expression in primaryhepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8:654-657.  [PubMed]  [DOI]

18.	Zheng JY, Li KZ, Wang WZ. Impact of the expression of p27KIP1 on apoptosis and progression of hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:883-886.  [PubMed]  [DOI]

19.	Hu PZ, Zhang CS, Ma FC, Yang SJ, Wang WL. Expressions of cyclin- dependent kinase inhibitor P21WAF1/CIP1 and PCNA in human hepatocellular c arcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:145-148.  [PubMed]  [DOI]

20.	Guo XZ, Shao XD, Xu JH, Zhao JJ, Li HY, Wang D. The expression of bcl-xL mRNA in the tissues of hepatocarcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:530-532.  [PubMed]  [DOI]

21.	Liang Y, Lu B, Cui ZF, Li XD, Guo YJ, Lu YJ. The expression of Fas/FasL in hepa tocellular carcinomas. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2001;9:1364-1368.  [PubMed]  [DOI]

22.	Zhang CS, Wang WL, Peng WD, Hu PZ, Chai YB, Ma FC. Bcl-2 ribozyme's promotion of apoptosis of SMMC7721 cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2000;8:417-419.  [PubMed]  [DOI]

23.	Lu SY, Pan XZ, Peng XW, Shi ZL, Lin L, Chen MH. Effect of Hp infection on gastric epithelial cell kinetics in stomach diseases. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2000;8:386-388.  [PubMed]  [DOI]

24.	Shoieb AM, Elgayyar M, Dudrick PS, Bell JL, Tithof PK. In vitro inhibition of growth and induction of apoptosis in cancer cell lines by thymoquinone. Int J Oncol. 2003;22:107-113.  [PubMed]  [DOI]

25.	Tu SP, Zhong J, Tan JH, Jiang XH, Qiao MM, Wu YX, Jiang SH. Induction of apoptosis by arsenic trioxide and hydroxyl camptothecin in gastriccancer cells in vitro. World J Gastroenterol. 2000;6:532-539.  [PubMed]  [DOI]

26.	Steinbach G, Lynch PM, Phillips RK, Wallace MH, Hawk E, Gordon GB, Wakabayashi N, Saunders B, Shen Y, Fujimura T. The effect of celecoxib, a cyclooxygenase -2 inhibitor, in familial adenomatous polyposis. N Engl J Med. 2000;342:1946-1952.  [PubMed]  [DOI]

27.	Zhou XD, Yu JP, Ran ZX, Luo HS, Yu BP. Expression of cFLIP and p53 mutation in adenocarcinoma of colon. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:536-539.  [PubMed]  [DOI]

28.	Cui J, Yang DH, Qin HR. Mutation and clinical significance of c-fms oncogene in hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2001;9:392-395.  [PubMed]  [DOI]

29.	Yang YL, Dou KF, Li KZ. Correlation of UPAR and VEGF expression with invasion and metastasis in human hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:381-383.  [PubMed]  [DOI]

30.	Guo J, Shen ZX, Tan SY, Luo HS, Li HX, Feng ZQ, Yang J. Expression of MDM2, P53 and P14ARF in human colon cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:540-543.  [PubMed]  [DOI]

31.	Johnson AJ, Hsu AL, Lin HP, Song X, Chen CS. The cyclo-oxygenase-2 inhibitor celecoxib perturbs intracellular calcium by inhibiting endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases: a plausible link with its anti-tumour effect and cardiovascular risks. Biochem J. 2002;366:831-837.  [PubMed]  [DOI]

32.	Arico S, Pattingre S, Bauvy C, Gane P, Barbat A, Codogno P, Ogier-Denis E. Celecoxib induces apoptosis by inhibiting 3-phosphoinositidedependent protein kinase-1 activity in the human colon cancer HT-29 cell line. J Biol Chem. 2002;277:27613-27621.  [PubMed]  [DOI]