修回日期: 2003-09-25
接受日期: 2003-10-12
在线出版日期: 2004-02-15
目的: 探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)和抗Fas单抗联合治疗结肠癌的效果及其机制.
方法: 分10 μg/mL 5-FU、抗Fas单抗(CH11)1 μg/mL、5 μg/mL 5-FU+0.5 μg/mL抗Fas单抗及空白对照四组, 与SW480细胞共培养. MTT法检测SW480细胞的存活率, TUNEL法检测SW480细胞的凋亡率. 免疫细胞化学法检测5-FU和抗Fas单抗处理前后, SW480细胞中Bcl-2的变化.
结果: 10 μg/mL 5-FU、1 μg/mL抗Fas单抗、5 μg/mL 5-FU+0.5 μg/mL抗Fas单抗均可抑制细胞生长, 且均可诱导细胞凋亡, 联合作用组诱导效果最明显, 其次是5-FU组, 抗Fas单抗组诱导效果较差. 抗Fas单抗、5-FU均可降低SW480细胞Bcl-2的表达, 5-FU与抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2蛋白的表达有协同抑制作用.
结论: 5-FU和抗Fas单抗对结肠癌细胞具有协同的增生抑制和诱导凋亡作用, 其机制可能是协同抑制Bcl-2蛋白的表达.
引文著录: 朱强, 刘吉勇, 许洪伟, 徐麟, 傅丽娜. 5-FU和抗Fas单抗联合治疗结肠癌的体外实验研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 469-471
Revised: September 25, 2003
Accepted: October 12, 2003
Published online: February 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(2): 469-471
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i2/469.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i2.469
免疫治疗是抗肿瘤治疗的一个重要方面, 药物治疗和免疫治疗相结合是抗肿瘤治疗的一个重要研究方向. Fas系统在结肠癌的肿瘤免疫中具有重要作用[1], 针对Fas系统的免疫治疗可能有一定效果. 本实验旨在观察治疗结肠癌的首选药物5-氟尿嘧啶(5-FU)和抗Fas单抗对结肠癌细胞株SW480的联合作用及其作用机制.
抗Fas单抗(CH11)购自深圳晶美生物工程有限公司, 细胞凋亡原位检测试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品.
1.2.1 5-FU和抗Fas单抗联合处理结肠癌细胞: 将对数生长期的SW480细胞按1×105/mL接种于96孔培养板, 24 h后分为10 μg/mL 5-FU组、1 μg/mL抗Fas单抗(CH11)组、5 μg/mL5-FU+0.5 μg/mL 抗Fas单抗组及空白对照四组, 与SW480细胞共培养.
1.2.2 MTT法检测细胞的增生活性: 四组细胞共培养0、24、48、72、96 h后, 做MTT染色. 以每毫升活细胞数为纵坐标, 培养时间为横坐标, 描绘SW480细胞生长曲线.
1.2.3 TUNEL法检测细胞的凋亡率: 将细胞以2×105/mL的密度接种在含小盖玻片的24孔培养板中, 24 h后分四组, 药物与细胞共培养, 作用0、24、48、72、96 h, 取出盖玻片, PBS冲洗3次, 用40 mL/L多聚甲醛溶液(溶于pH7.4的PBS中), 室温固定30 min, TUNEL染色, 检测细胞的凋亡率. 计数1 000个细胞, TUNEL阳性细胞与总细胞数的比值即为SW480细胞的凋亡率.
1.2.4 免疫细胞化学法检测处理前后细胞中Bcl-2的变化: 将细胞以2×105/mL的密度接种在含小盖玻片的24孔培养板中, 24 h后分四组药物与细胞共培养72 h后, 取出盖玻片, PBS冲洗3次, 用950 mL/L酒精固定20 min, 免疫细胞化学法检测处理前后细胞中Bcl-2的变化, 免疫化学过程参照S-P试剂盒操作说明书.
统计学处理 两个样本均数的比较采用t检验, 多个样本均数的比较采用单因素方差分析(F-q验), 显著性水准α为0.05.
10 μg/mL 5-FU、1 μg/mL抗Fas单抗、5 μg/mL 5-FU+0.5 μg/mL 抗Fas单抗均可抑制细胞生长, 联合作用组抑制效果最明显, 其次是5-FU组, 抗Fas单抗组抑制效果较差(图1).
10 μg/mL 5-FU、1 μg/mL抗Fas单抗、5 μg/mL 5-FU+0.5 μg/mL 抗Fas单抗均可诱导细胞凋亡. 在48 h时, 5-FU组、抗Fas单抗组、联合组的凋亡率, 与空白对照组相比均有统计学差异(P<0.05); 在72 h时, 联合组的凋亡率、5-FU组和抗Fas单抗组两两相比, 均有统计学差异(P<0.05), 联合作用组诱导效果最明显, 其次是5-FU组, 抗Fas单抗组诱导效果较差(图2).
与细胞共培养72 h后, 抗Fas单抗组、5-FU组和抗Fas单抗+5-FU联合组中, SW480细胞Bcl-2阳性细胞率与空白对照组相比均有统计学差异(P<0.05); 抗Fas单抗组、5-FU组和联合组两两相比, 均有统计学差异(P<0.05), 抑制SW480细胞Bcl-2表达的强度由高到低依次是联合组、5-FU组、Fas单抗组. 以上结果表明, 抗Fas单抗、5-FU均可抑制SW480细胞Bcl-2的表达, 5-FU与抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2的表达有协同抑制作用. 10 μg/mL 5-FU比1 μg/mL抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2表达的抑制作用强(表1)(图3, 4).
| 分组 | Bcl-2阳性细胞率(% mean±SD) |
| 空白对照组 | 81.2±2.74 |
| 抗Fas单抗组 | 65.3±2.68 |
| 5-FU组 | 59.5±3.08 |
| 联合组 | 43.9±1.97 |
Fas系统包括Fas及其配体FasL. Fas系统在结肠癌的发生、发展过程中起着重要的作用, 结肠癌细胞可减少其细胞表面Fas表达, 逃逸机体免疫系统的监视, 避免免疫系统的杀伤; 结肠癌细胞还可增加其细胞表面FasL表达, 反击机体免疫系统, 诱导淋巴细胞凋亡[1]. 针对结肠癌Fas系统的药物治疗和免疫治疗可能在一定程度上能够治疗结肠癌.
本实验证实, 10 μg/mL 5-FU、1 μg/mL抗Fas单抗、5 μg/mL 5-FU+0.5 μg/mL 抗Fas单抗均可诱导SW480细胞凋亡. 1 μg/mL抗Fas单抗与其他两组相比作用较弱, 这是因为抗Fas单抗通过与SW480细胞上的Fas相结合, 从而诱导细胞发生凋亡. 但结肠癌细胞SW480一方面Fas表达较少[2], 另一方面SW480细胞中存在着Fas信号传导障碍[3], 因此单独应用抗Fas抗体诱导肿瘤细胞凋亡效果是有限的.
在临床上治疗结肠癌时, 大剂量5-FU可出现骨髓抑制、胃肠道反应等副作用. 本实验将小剂量5-FU和抗Fas单抗联合处理结肠癌细胞SW480发现, 尽管5-FU和抗Fas单抗的剂量均减半, 但比单独应用5-FU和抗Fas单抗诱导SW480细胞凋亡的作用增强, 药物处理后的肿瘤细胞对抗Fas单抗诱导凋亡的敏感性增加. 5-FU和抗Fas单抗对诱导SW480凋亡有协同作用, 可以降低5-FU的用量, 减少副反应的发生.
Fas途径调节细胞凋亡过程与Bcl-2的表达存在某种程度的耦联, Bcl-2的表达可以部分地阻断Fas介导的凋亡[4-5]. 本实验结果表明, 5-FU和抗Fas单抗对SW480细胞Bcl-2蛋白的表达有协同抑制作用, 可以降低Bcl-2的表达率, 增强Fas信号传导. 5-FU还可以诱导SW480细胞表达Fas增加[1], 这也可以解释在诱导SW480细胞凋亡时, 5-FU比抗Fas单抗作用明显.
编辑: N/A
| 1. | Bennett MW, O'Connell J, Houston A, Kelly J, O'Sullivan GC, Collins JK, Shanahan F. Fas ligand upregulation is an early event in colonic carcinogenesis. J Clin Pathol. 2001;54:598-604. [PubMed] [DOI] |
| 3. | Lee SH, Shin MS, Lee HS, Bae JH, Lee HK, Kim HS, Kim SY, Jang JJ, Joo M, Kang YK. Expression of Fas and Fas-related molecules in human hepatocellular carcinoma. Hum Pathol. 2001;32:250-256. [PubMed] [DOI] |