修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15
乙型肝炎病毒(HBV)的感染, 与肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关. 关于HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合, 在HCC的发病过程中具有十分重要的意义. 经过30年的积累, 形成了一整套研究HBV DNA整合有效的研究技术. 参与整合的HBV DNA片段大小不等, 主要包括乙型肝炎病毒编码反式调节蛋白的基因区段, 如X基因和羧基末端截短的表面抗原中蛋白的编码基因等. 关于HBV DNA整合位点也没有明确的特异性位点. HBV DNA与肝细胞基因组DNA整合之后, 引起了肝细胞染色体的不稳定性, 甚至导致染色体的异常转位. 整合的HBV DNA可通过调节基因序列启动指导细胞恶性转化的相关基因, 同时HBV DNA整合的基因片段编码的反式激活蛋白可激活细胞生长及恶性转化的基因, 导致正常肝细胞的恶性转化. 与HBV DNA基因整合相关蛋白的研究还处于初级阶段, 包括15AB结合蛋白、小鼠上游结合因子结合蛋白、DNA结合蛋白A、整合序列结合蛋白3以及转录因子阴和阳1蛋白有关. 关于HBV DNA整合机制和后果的研究, 必将进一步阐明HCC发生的分子生物学机制, 为探索新型的治疗技术和治疗方法奠定基础.
引文著录: 成军. 乙型肝炎病毒DNA整合的机制及后果. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 420-427
Revised: August 10, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(2): 420-427
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i2/420.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i2.420
乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒, 但是在其生活周期中却存在独特的DNA-RNA-DNA的复制过程[1]. 在HBV感染的长期过程中, 从流行病学和临床研究资料, 积累的大量证据表明HBV感染与肝细胞癌(HCC)的发生发展有着十分密切的联系[2-4]. 在HCC肝组织中检测到整合的HBV DNA整合子(integrant)的存在, 相信HBV DNA与肝细胞基因组之间的整合在HCC的发生发展过程中具有重要的作用[3-5]. 但是, HBV DNA与肝细胞基因组DNA整合的规律我们还知之甚少. 关于HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合已经积累了较为丰富的研究资料, 对阐明HBV感染与HCC之间的关系具有重要的意义[6].
对于肝组织中整合的HBV DNA的研究, 早期阶段多采取的方法是构建HBV相关性HCC肝组织的基因组DNA文库, 然后以HBV DNA不同的基因片段作为探针, 进行杂交筛选, 然后对阳性克隆进行序列测定分析[7-15]. Tsuei et al[16]以1例9岁HCC患者的肝组织DNA构建了噬菌体λL47.1为载体的基因文库, 经杂交筛选获得阳性克隆, 之后的序列分析结果表明, 整合的HBV DNA序列发生了缺失和重排, 整合序列主要包括表面抗原蛋白编码基因和X基因, 这些基因已经发生了反方向的基因重排. 整合的基因序列不包括HBV核心蛋白编码基因, 整合的X基因编码产物保留了对于异源性启动子的反式激活作用. 构建基因组DNA文库的技术比较繁琐, 筛选的工作量也偏大, 对于大多数实验室条件来说不合适, 不能作为常规的HBV DNA整合的研究技术推广[17-25].
多聚酶链反应技术(PCR)的建立和发展对于研究HBV DNA整合研究来说意义重大. 只要设计合适的PCR引物, 可以很容易地进行整合HBV DNA序列的检测, 同时也可以对大批量的标本进行处理, 简单有效. 关于PCR技术的应用引物设计是关键所在. 因为事先不清楚整合的是HBV DNA的哪一段基因, 也不清楚整合位点的细胞基因序列, 因此, 引物设计的质量直接影响PCR扩增的效率[26-32]. Minami et al[33]根据已知基因序列和人Alu重复(Alu repeat)序列分别设计引物, 建立克隆整合的HBV DNA及其相邻的细胞基因序列的PCR技术. 为了避免扩增Alu重复序列之间的DNA片段, 引物中引入dUTPs, 并且在PCR的10个循环之后, 以尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase)进行处理. 应用这一技术在3例HCC组织中克隆了与HBV DNA整合的相邻的细胞基因序列, 是研究HBV DNA整合的理想技术途径.
研究HBV DNA整合的另一项基于PCR扩增的技术就是反向PCR(IPCR)技术. 反向PCR技术在HBV DNA整合的研究中也具有重要的意义[34-42]. Tsuei et al[43]研究发现在80%以上HBV相关性HCC肝组织可以检测到HBV DNA的存在, 但目前还不清楚其在HCC发生发展过程中的机制. Tsuei et al[44]对受环境因素影响较小的儿童HCC肝组织中的HBV DNA整合情况进行了研究. 应用顺向重复序列1(DR1)和顺向重复序列2(DR2)基因序列设计引物的反向PCR技术对于整合HBV DNA及其相邻的细胞基因序列进行扩增, 10例HCC有9例扩增的HBV DNA序列位于DR1和DR2附近, 而且都属于I型整合子. Southern blot 杂交分析结果表明, 5例中有2例男性特有的细胞基因序列, 即与人长散布DNA元件(human long interspersed DNA element, LINE-1)同源. 在1例HBV整合子中发现HBV DNA整合到RNA结合域Y染色体(RNA binding motif Y chromosome, RBMY)基因之中. RBMY基因表达仅限于男性精子细胞中, 在非HCC组织中没有检测到这种基因的表达. HBV DNA在RBMY位点的整合以及对这一基因表达的激活, 可能是儿童HCC发生的机制之一.
原位的PCR扩增技术在HBV DNA的整合研究中也有重要应用[45-56]. Matsui et al[57]利用高度敏感的荧光原位PCR(fluorescence in situ polymerase chain reaction, FISPCR)技术对HCC组织中整合的HBV DNA进行检测, 发现亚历山大细胞(Alexander cell)中有较强的荧光存在, 并可以在一定程度上进行定量分析.
乙型肝炎病毒的基因组结构复杂, 结构基因与调节基因、结构基因之间相互重叠, 反映出HBV DNA的高度紧密型的DNA结构, 因此一段基因序列的整合, 可能会涉及到多个编码基因的功能, 因此需要对于整合的HBV DNA的基因片段进行研究, 以总结HBV DNA整合的片段和后果[58-66]. 总的来讲, 整合的基因片段多集中在HBV DNA的2个反式激活的蛋白的编码基因区, 即HBV的表面抗原, 特别是羧基末端截短型的表面抗原的基因整合, 以及具有反式激活功能的X蛋白编码基因的整合[67-78].
Takada et al[79]发现整合的HBV DNA中X基因的表达有时与细胞DNA融合, 而且以细胞的多聚腺苷酸信号终止. 整合的X基因序列分析结果表明, 常有X蛋白羧基末端的5个氨基酸残基的缺失, 但是, 其上游在各种嗜肝DNA病毒基因序列中高度保守的7个氨基酸残基序列却始终存在. Yaginuma et al[80]在兄弟2人的HCC儿童患者肝组织中发现了多个位点的HBV DNA整合, 2例组织中整合的HBV DNA基因结构类似, 没有发生重排. Wang et al[81]对人HCC细胞系HAGS 2.1中整合的HBV DNA应用IPCR技术进行了检测, 以期发现新的整合位点. 整合的HBV DNA片段位于C基因区的2 111 nt到X基因区的1 558 nt. 整合的HBV DNA片段长度大约是2.6 kb, 包括部分C基因序列、P区和X基因, 以及完整的S基因. 整合的HBV DNA基因的侧翼的细胞基因序列与人卫星III重复序列有高度的同源性. 这一重复序列的左右两侧, 分别有43和56个GGAAT重复序列. 尽管在HAGS 2.1细胞系中发现的HBV DNA整合序列及其周围的细胞序列目前还不能用于解释HCC的发病机制, 但本项研究所采用的技术提示可以获得更高的检测阳性率. 相当一部分的HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者存在前-C区的基因变异, 但是这种前-C/C基因的突变与肿瘤是否有关, 是否是野生型HBV DNA与肝细胞基因组发生整合以后的选择结果尚不清楚. Zhong et al[82]对HBV相关的HCC进行研究, Southern blot 杂交分析发现43/56例患者的HCC组织中存在整合的HBV DNA, 肿瘤组织基因突变发生率为 65% (26/40), 而非肿瘤组织为45% (14/31). 使HBeAg合成停滞的1 896位点的突变在肿瘤组织中为40% (16/40), 在非肿瘤组织中为35.4% (11/31). 其他位点例如1 899、1 898、1 912和1 886位点的突变都可以见到, 但肿瘤和非肿瘤组织中的阳性率没有显著差别. 结果表明在机体免疫压力作用下, 前-C/C基因突变逐渐上升, 这种突变可能促进HBV DNA的整合以及肿瘤的发生. Urashima et al[83]以全长HBV DNA、X和前-S2/S基因片段作为探针进行Southern blot杂交分析, 发现HBV DNA整合的比率为57.1% (16/28), X基因在87.5%(14/16)的患者中存在, 前-S2/S基因的阳性率为37.5%(6/16). Laskus et al[84]用PCR技术对于慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中整合的HBV DNA进行检测, 整合的序列位于HBV DNA的DR1、DR2区. 除了在肝细胞中发现整合的HBV DNA之外, Tagieva et al[85]在神经母细胞瘤细胞中检测到了整合的HBV DNA, 整合的HBV DNA结构完整, 只是存在一段480 bp片段的缺失突变. 整合的HBV DNA片段包括C基因、前-S和S基因, 以及3'-末端截短型的X基因. 另外, Wei et al[86]对于土拨鼠乙型肝炎病毒(WHBV)的整合情况进行了研究, WHBV DNA整合片段包括表面抗原基因、病毒增强子序列以及各种类型的截短型X蛋白反式激活剂. 整合的WHBV X基因编码产物仍然保留了对异源性启动子的反式激活作用.
Goto et al[87]对儿童慢性HBV感染者肝组织中整合的HBV DNA进行研究, 发现存在多个随机整合位点, 说明在HBV感染的早期阶段就已经发生了HBV DNA的整合. Hino et al[88]对于C3和C4两个单一整合子的序列进行分析, C3克隆的整合的HBV DNA的5'-末端位于HBV DNA的1 824 nt处, 即顺相重复序列DR1位点, 或者是HBV DNA双链的负链3'末端的6 bp处. 右侧的HBV DNA序列位于1 762 nt处, 与整合位点的细胞基因序列有5 bp的重叠, 细胞基因序列中在整合位点存在11 bp的缺失突变. 克隆C4的分析结果表明, 一端位于1 820 nt处, 即HBV DNA负链的3'-末端的2 bp处. 因此, HBV DNA负链的顺相重复序列可能是HBV DNA整合的热点序列. Chang et al[59]在台湾5/8例儿童HCC肝组织中检测到了整合的HBV DNA, 其中4例为单一位点整合, 1例为多位点整合. 进一步研究表明, X基因和表面抗原基因是最常见的整合序列. 单点整合可能是因为关键位点的整合造成插入突变的发生, 造成生命的早期阶段即发生HCC. Nakamura et al[89]检测到包括几乎完整HBV DNA的整合子, 整合靶基因在整合位点处有15 bp的缺失, 整合的靶基因与病毒基因有相当高的同源性. Zhou et al[90]在中国大陆HCC患者的研究中发现, HBV DNA的整合仅仅是1个或2个拷贝的HBV DNA, 很少有完整的HBV DNA发生整合, 而且没有发现整合的热点序列. HBV S基因总是存在, 一般情况下X基因也存在, 而很少检测到C基因.
Okubo et al[91] 对HBV DNA在肝细胞整合的情况进行总结, 认为HBV DNA在肝细胞中的整合可以分成I、II、III型. I型整合子属于简单型(simple type), 病毒基因组的结构非常简单, 部分已经缺失. 病毒的黏性末端序列仅见于1处病毒-细胞DNA连接处, 整合位点处的细胞DNA存在小片段的缺失. 这种整合可能是HBV DNA复制的中间产物作为整合的底物. 这一类型的整合是最为常见的. 第二种就是II型整合, 称为复杂型(complex type), 与I型整合类似, 但整合的病毒基因组比较复杂, 形成过程与I型相似, 但整合底物却是新型DNA(novel form DNA). 在胎儿肝细胞的实验感染研究过程中, 感染HBV以后几天时间就可以见到整合的HBV DNA. 其中就发现了第三种整合子, 即III型整合子, 具有较为简单的病毒基因序列, 但却存在较大范围的细胞DNA的缺失. 在整合过程中, 不同的HBV DNA形式都参与了整合过程, 可以引发大小不等的细胞基因组DNA片段的缺失. 最为常见的就是简单HBV DNA片段的整合, 只是引起细胞基因组DNA的小片段的缺失[92-107].
对于HBV DNA在肝细胞整合的位点进行分析, 虽然发现了一些有倾向的整合热点, 但是, 总的来讲, HBV DNA整合的位点还是随机的[108-115]. Chen et al[116]应用IPCR技术对于HCC组织中整合的HBV DNA及其邻接的细胞DNA序列进行分析, 发现整合位点其中之一就是人28 S rRNA的编码基因. Quade et al[117]对1例日本HCC患者肝组织中整合的HBV DNA及其周围的序列进行分析, 获得了一段3 125 nt的基因片段, 包括未经重排的HBV DNA序列和相邻的细胞基因序列. HBV DNA属于adr亚型, 相当于HBV DNA的1 970-1 886 nt之间的序列. 在右侧病毒与细胞基因的连接点有7 bp (TGTAGGC)序列的重复, 还有2 bp的颠换. 整合的HBV DNA包括完整的核心基因、前-S、S、多聚酶和3'-截短的X基因. 大部分前-C区基因缺失. 整合位点是病毒基因组的热点突变区, 在细胞中则是位于β-珠蛋白基因组DNA 3'-末端的半重复序列. Huang et al[6]对于HBV DNA在精子细胞中的整合情况进行了研究, 利用生物素标记的全长的HBV DNA作为探针的FISH技术对精子细胞中整合的HBV DNA进行检测, 在1例慢性迁延型乙型肝炎患者的精子细胞中检测到了整合的HBV DNA, 说明HBV DNA可以整合到人精子细胞的染色体中. Kuo et al[118]在HBV DNA整合位点发现ATP合酶6(ATP synthase 6)和细胞色素C氧化酶III(cytochrome C oxidase III), 但是这些序列都是异常地连接在一起. 因为HBV的感染可能造成细胞能量代谢的异常, 这两种线粒体酶的异常可以部分解释HCC的形成过程.
Pineau et al[119]对2例朝鲜患者单一的整合位点的基因序列进行分析, 发现都有反向的病毒基因或相邻的细胞基因的双拷贝化, 整合的位点位于富含AT的拓扑异构酶I和II 裂解的靶序列位点, 以及有重组倾向的序列位点. 整合位点定位于 8q13 和10q22, 这两个基因区段都含有肿瘤相关基因. 对于指导整合子表达的顺式作用序列(cis-activating sequence)利用HepG2细胞系的瞬时转染技术进行研究, 整合的基因序列对于异源型的启动子具有反式激活作用, 但是对于相邻报告基因的激活没有或者仅有较弱的抑制作用. Chen et al[120]研究了1例台湾HCC患者肝癌组织建立的细胞系HCC36中HBV DNA的整合情况, 发现至少存在4个整合位点. 以HCC36细胞的DNA建立了基因组DNA文库, 获得含有HBV DNA片段的两个噬菌体克隆λ36A 和λ36B, 前者HBV DNA序列相当保守, 后者存在有效范围的缺失或插入, 两个克隆的HBV DNA序列只有4个核苷酸位点的差异. λ36A克隆插入序列为人Alu重复序列, 而克隆λ36B的插入位点是卫星DNA序列.
Yamamoto et al[121]分离到HBV DNA整合的HCC细胞系来源的基因克隆DA2-6, 证实该整合的基因克隆包括3.7 kb侧翼细胞序列和2.8 kb的HBV DNA序列, 包括前-S、S和3'-末端截短型X基因. 利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)作为报告基因对于整合的HBV DNA基因片段编码产物的反式激活作用进行研究, 证实具有明确的、广泛的反式激活作用. Zhang et al[122]在HCC肝组织中发现了HBV DNA整合位点在癌基因erb B附近, 序列分析结果表明, 整合的HBV DNA基因位于细胞的表皮生长因子(EGF)和其他细胞受体的酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase)催化位点的附近. Berger et al[123]对PLC/PRF/5细胞(Alexander细胞)进行研究, 在2个HBV DNA整合克隆AL-14和AL-26中没有发现细胞DNA的重排, 只有较小片段的缺失. 在克隆AL-14中有2 kb的缺失, 在克隆AL-26中仅有17 bp的缺失. AL-26克隆的右侧有182 bp基因序列, 以前相信是来源于细胞的基因序列, 但经过研究证实这一序列是一种不寻常的HBV DNA片段. 令人惊奇的是这一段HBV DNA序列与WHBV DNA高度同源. 在AL-14和AL-26克隆中都含有小卫星样重复序列(minisatellite-like repetitive sequence). 因此认为人基因组DNA中的重复序列可能是HBV DNA整合的热点之一[124-131].
乙型肝炎病毒DNA在细胞中的整合, 首先注意到的是在染色体上的位点和染色体的异常转位(translocation), 这些细胞遗传学上的异常, 是HBV DNA整合, 引起肝细胞肿瘤的重要机制所在. Simon et al[132]在HCC组织和肝癌细胞系Hep 40细胞中发现了整合的HBV DNA, 在HCC组织中发现1p36染色体位点的异常, 在正常肝组织中这种染色体的异常是不存在的. Livezey et al[133]研究证实Hep G2215较母本细胞Hep G2的生长速度减慢. HBV转染的细胞系可以在裸鼠体内缓慢形成肿瘤, 但是母本细胞却不能在裸鼠体内形成肿瘤. Hep G2T14.1 细胞系在裸鼠体内形成的肿瘤组织中, HBV状态没有发生改变. 但在Hep G2215形成的肿瘤组织中检测到了一个新的整合位点. 在Hep G2215细胞系形成的肿瘤组织中仍然存在HBV的复制, 在Hep G2T14.1细胞系形成的肿瘤组织中仍然没有HBV的复制. Hep G2215细胞系中检测到几处染色体重排和肿瘤抑制基因p53位点的杂合子丢失(loss of heterozygosity, LOH). Western blot杂交分析结果表明, 肿瘤抑制蛋白p21/Waf1表达上调. Su et al[134]从一株肝癌细胞系Hep3B中克隆到整合的HBV DNA, 病毒细胞基因序列结合点分析, 属于I型整合, 表面抗原主蛋白的开放读码框架(ORF)保持完整, 而前-S1和C区基因发生重排, X蛋白在羧基末端截短, 但仍然保留了对于SV40增强子/启动子的反式激活作用. S1 核酸酶作图分析结果表明, 4.0、2.9、2.2 kb的HBV RNA在Hep3B细胞中都存在, 这一整合子的转录在前-S2/S启动子的指导下进行. 利用体细胞杂合作图分析(somatic-cell hybrid mapping), 左右两侧的细胞基因序列分属于13和4号染色体. 提示HBV DNA的整合造成染色体DNA的结构重排, 羧基末端截短型X的反式激活作用在HCC的形成过程中也具有重要意义.
Tokino et al[135]在HBV DNA整合的肝组织中发现了大片段的染色体基因组DNA的缺失现象, 分别为25、12、11 kb. 每一个整合子都含有很小的病毒基因片段. Tokino et al[136]对于整合的HBV DNA的随机克隆进行序列分析, 只发现11号和17号染色体是HBV DNA整合发生的高频率染色体, 但是没有发现特异性HBV DNA整合位点. Slagle et al[137]认为HCC发生的原因可能很多, 其中之一便是整合位点的HBV DNA激活了重要基因的表达. 在1例患者中发现在17p11.2-12位点存在HBV DNA整合, 而且在整合位点的细胞基因序列成双拷贝化. 以这一基因片段作为探针, 对于中国HCC患者的肝组织进行检测, 发现这一基因片段的异常决不鲜见. Hatada et al[138]在一个具有4个整合位点的HCC组织中, 鉴定出11 q13.3号染色体上的hst-1是一种转化基因, 另外一个整合子位于 hst-1基因附近. 转化基因hst-1与整合的HBV DNA有共扩增现象, 共扩增的范围也是十分有限的. 说明HBV DNA的整合、扩增与癌基因的激活可能是HBV相关的HCC发生的重要的分子生物学机制. Henderson et al[139]发现整合的HBV DNA左侧序列是位于18q11.1-q11.2的基因序列, 右侧序列是4号染色体末端的基因序列, 提示HBV相关的HCC可能与染色体的异常转位有关.
Minami et al[33]在3例HCC组织中克隆了与HBV DNA整合的相邻的细胞基因序列, 是研究HBV DNA整合的理想技术途径. Zhou et al[140]从上海的1例HCC肝组织中分离到9 kb的整合子基因序列, 序列中包括反向的病毒和细胞的基因序列, 其中病毒的基因序列包括核心基因、前-S区和部分的X 、S基因. 整合子中包括3 kb的细胞基因序列, 整合位点位于HBV DNA的DR1区的第11 nt处, 与之邻接的是HBV的X基因, 包括黏性重叠区. 这一段细胞基因位于染色体的 17p11.2-17p12之间, 与p53基因很近. 对相邻的细胞基因序列进行分析, 发现有一70 bp的基因片段, 在多个染色体位点上都有存在, 其中包括人自主复制序列1(ARS1). Meyer et al[141]在人HCC组织中分离的整合的HBV DNA序列, 包括2个拷贝的X基因及其启动子和增强子序列(717-1 796 nt)和3'-末端截短型的前-S/S基因(2 703-2 423 nt). 由于整个前-C/C基因片段的缺失, 导致X基因的3'-末端与前-S基因融合, 表明HBV DNA的整合过程, 包括HBV DNA的插入整合, 以及整合HBV DNA基因序列之间的重组等2个步骤, 才最终形成目前从HCC组织中所发现的HBV DNA整合子. 位于整合位点的5'-和3'-末端的细胞基因序列包括17号染色体上的α卫星DNA序列, 以及14号染色体上的短臂序列p14-pter, 说明HBV DNA的整合引发了异常的染色体转位. 不少研究结果报道17号染色体是HBV DNA整合的热点区, 相信包括携带p53基因的这一染色体结构区的HBV DNA整合, 在HCC的发生发展过程中具有重要意义. Dandri et al[142]以Southern blot杂交技术对HepG2 2.2.15细胞系中整合的HBV DNA进行了分析, 大约10%的HepG 2.2.15中有HBV DNA的整合. 以过氧化氢处理细胞以增加细胞中DNA的不稳定性, 可以将有HBV DNA的细胞的比率提高到50%, 抑制DNA修复的多聚(ADP-核糖基化)-1(PARP-1)同样可以使HBV DNA整合的比率提高到50%. 说明氧化应激造成的细胞DNA的不稳定, 可以促进HBV DNA的整合. PARP-1的活性可能是HBV DNA整合的关键酶类.
HBV DNA整合除了造成细胞基因组的插入激活, 还造成了基因重排, 激活癌基因的表达, 造成肝细胞的恶性转化. Pineau et al[143]发现在HBV相关性HCC组织中存在t(3; 8) 的染色体转位现象. 一边是8p23整合位点, 位于羧基肽酶N(carboxypeptidase N)编码基因的附近, 在肝组织中这种酶的转录水平很高, 在HCC和其他表皮细胞肿瘤组织中经常出现缺失突变. 另一边是3q27-29, 这是一个多种肿瘤类型如大细胞型淋巴瘤等都能见到的多发性染色体转位位点. 本研究结果为HBV诱导的染色体转位, 进而为引发HCC的理论提供了直接的证据.
Wang et al[144]在HBV DNA整合位点的研究中发现HBV DNA可以在细胞周期素A的内含子序列中整合, 从HCC的cDNA文库中筛选到几个HBV-细胞周期素A的杂合体, 编码HBV-细胞周期素A的融合蛋白, 在细胞周期素A的N-末端有缺失, 包括细胞周期素A的信号肽序列和细胞周期素降解有关的结构序列, 而代之以前-S2/S基因序列, 整个融合蛋白的表达在前-S2/S启动子的指导下进行. 这种融合蛋白与天然的细胞周期素A蛋白相比较, 是高水平表达的, 表达方式是持续的, 而且这种融合蛋白由于缺失突变的原因还不易被降解, 因此细胞周期素A的作用显著加强. 这种不易被降解的细胞周期素A蛋白的持续高水平的表达, 是HBV DNA基因整合与HCC发生有关的主要机制之一. Kajino et al[145]在体外HBV DNA整合的研究中发现亚基因组15AB (1 855-1 914 nt)片段的整合较为常见, 而且还有15AB结合蛋白的存在. 这种蛋白的存在可能是HBV DNA与肝细胞基因组整合的相关蛋白造成肝细胞基因组不稳定、肝细胞癌发生的主要因素. 利用Southwestern筛选技术, 鉴定出小鼠上游结合因子(upstream binding factor, UBF)和DNA结合蛋白A(DNA binding protein A, dbpA), 其中UBF属于含有HMG结构域的蛋白家族成员, 而dbpA则属于Y盒结合蛋白家族的成员(Y box binding protein). 与15AB的结合似乎是保守的DNA结构域与这一家族蛋白之间的结合来介导的. 因为HMG1 和YB-1等这一家族的成员也可以与15AB结合. 因此考虑这些家族成员的蛋白成分可能与HBV DNA与细胞基因组之间的重组过程有关.
Nakanishi-Matsui et al[146]的研究结果表明HBV DNA与细胞基因组整合的邻接位点, 即HBV DNA的整合序列(integrated sequence, IS)总有一段与顺相重复序列1相邻的25 bp 的基因片段. 从HepG2 细胞中分离纯化到一种与IS序列相结合的蛋白, 称为IS结合蛋白3(IS binding protein 3, ISBP3). 对于ISBP3进行序列分析, 证实与转录因子阴和阳1(YY1)是同一种蛋白. 针对YY1羧基末端的单克隆抗体也可以在Western blot杂交分析和电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)中识别ISBP3.另外, ISBP3还可以与YY1的结合蛋白Y3这种促进多瘤病毒分子内重组的蛋白结合. 尽管目前的研究证实YY1是一种转录因子蛋白, 但IS却从未表现出与前-C和前基因组RNA的转录有关. 因此, 考虑YY1与线性复制的HBV DNA分子内部的重组有关. 研究表明, YY1在HBV DNA与细胞基因组DNA之间的整合过程中具有重要作用. Yamamoto et al[147]在HBV DNA顺式转染的HepG2细胞系中, 发现整合的HBV DNA编码的反式激活蛋白可反式激活原癌基因c-fos等的表达. Dejean et al[148]对于单一整合位点的HBV DNA整合基因进行序列分析比较, 发现HBV DNA整合发生的位点是甲状腺/类固醇激素受体DNA结合位点的编码基因的外显子. 从中克隆的HBV DNA 整合的靶基因hap编码视黄酸受体. 因为视黄酸调节细胞生长与分化基因的表达, 因此认为HBV DNA的整合造成在正常情况下表达水平较低的hap基因表达水平显著升高, 造成正常肝细胞的恶性转化. Hsu et al[149]对33份由WHV感染引起的HCC组织中病毒DNA的整合进行了检测, 发现整合的病毒基因序列包括增强子基因序列, 还检测到不同的癌基因的表达, 如c-myc、N-myc、c-fos、c-jun和jun-B等. 有2份标本中见到c-myc表达激活是由于WHV DNA在c-myc编码区附近整合而引起的. 说明病毒基因整合对于c-myc的激活也是HCC发生的重要机制. Takada et al[150]以Southern blot杂交技术对整合HBV DNA进行检测, 在15/16组织标本中, 发现了随机位点的HBV DNA整合, 对于3份标本中19个整合子进行序列分析, 发现整合的HBV DNA反向双拷贝化, 或者转位到细胞重要基因附近. 因此, HBV DNA的基因重排或者对于整合位点附近的细胞DNA表达的影响, 就是HBV相关的HCC发生的重要的分子生物学机制. 但是对于整合位点的细胞DNA进行分析, 除了发现小片段的缺失之外, 并没有显著的结构异常. 提示HBV DNA 反向重排或双拷贝化在整合之前就发生了. 对于病毒-病毒相邻序列的分析, 提出了HBV DNA与HCC相关的反向双拷贝化机制. Wang et al[151]在早期HCC组织中单一HBV DNA整合位点发现了细胞的整合位点基因序列, 这一基因序列转录1.8 kb和2.7 kb的mRNA, 编码产物为432 aa的蛋白, 相对分子量为48 536, 与人细胞周期素A蛋白同源. HBV DNA整合的位点位于细胞周期素A的内含子(intron)区, 因为细胞周期素A是细胞周期的重要调节蛋白[152-153], 部分揭示了HBV相关性HCC的形成过程.
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