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世界华人消化杂志. 2004-02-15; 12(2): 401-403
在线出版日期: 2004-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i2.401
乙型和丙型肝炎病毒与胱冬肽酶3的关系
纪冬, 成军, 王建军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花
纪冬, 成军, 王建军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. C39970674, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-07-12
修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 纪冬, 成军, 王建军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花. 乙型和丙型肝炎病毒与胱冬肽酶3的关系. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 401-403
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: July 12, 2003
Revised: August 10, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

凋亡(apoptosis)又称为程序化细胞死亡(programmed cell death, PCD), 是多细胞有机体为调控机体发育, 维护内环境稳定, 由基因控制的细胞主动死亡过程[1], 他的发生是一系列称为胱冬肽酶(cysteinyl aspartate-specific protease, caspase)蛋白酶家族成员的作用, 由活性中心的半胱氨酸上的巯基发挥活性, 所以属于半胱氨酸酶类. 胱冬肽酶蛋白酶家族也称为ICE/Ced-3家族, 是一组与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白酶, 是美丽线虫(Caenorhabditis elegans)死亡基因Ced-3的同源物, 这个家族的蛋白酶具有特异性地在特定的氨基酸序列中将肽链从天门冬氨酸(Asp)之后切断的活性. 经过近几年的工作, 目前已经从人和动物细胞中克隆到十几种这样的蛋白酶, 1996年Alnemri et al[2]提出将人源性的ICE/Ced-3蛋白酶统一命名为"胱冬肽酶", 并将已经克隆出来的人白介素1β转化酶(Interleukin-1βconverting enzyme, ICE)蛋白酶等依次命名为胱冬肽酶1-10, 如ICE为胱冬肽酶1, TCH 1为胱冬肽酶2, 半胱氨酸蛋白32（CPP32）为胱冬肽酶3等, 他们在转染宿主细胞后均能引发细胞凋亡并都被牛痘病毒Crm A蛋白或一种四肽化合物(YVAD)抑制[3]. 其中胱冬肽酶3是胱冬肽酶家族中最重要的凋亡执行者之一, 在凋亡的执行阶段, 负责对全部或部分关键性蛋白的酶切(激活或灭活). 在慢性肝炎病毒致病(癌)过程中, 凋亡起着重要的作用, 通过病毒蛋白或识别病毒抗原的细胞毒T淋巴细胞(CTL)可使病毒感染细胞发生凋亡, 是宿主清除病毒的机制[4]. 慢性肝炎病毒与凋亡过程中的许多酶都存在着互相作用, 胱冬肽酶3是肝炎病毒作用的重要靶位, 了解肝炎病毒对胱冬肽酶3的影响, 对于肝炎病毒慢性感染的形成, 甚至是肝炎病毒相关性肝癌(HCC)的发生机制的研究具有重要意义．

1 胱冬肽酶3与凋亡

1994年Fernandes-Alnemri et al[5]在BenBank中的表达序列标记(expression sequence tag, EST)数据库中找到一段ICE/Ced-3活性中心同源的序列, 用他合成探针后, 筛选人Jurkat T淋巴细胞cDNA文库, 从中克隆到一种新基因, 因其编码分子量为32 kD的半胱氨酸蛋白酶而称之为半胱氨酸蛋白 (cysteine protease protein, CPP32), 1996年命名为胱冬肽酶 3. 胱冬肽酶3 cDNA编码277个氨基酸, 其中30%与ICE同源, 35%与Ced-3同源, 是迄今为止发现的所有ICE家庭成员中与Ced-3同源性最高的. 因此, 有人提出胱冬肽酶3可能是哺乳动物中Ced-3相对应物. 现在一般认为胱冬肽酶3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶, 也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分. 他广泛分布于各种不同类型的细胞中, 前胱冬肽酶3在活化过程中从Asp28-Ser29和Asp175-Ser176两处被剪切, 形成P17(29-175)和P10(182-277)两个片段, 两种亚基再组成活性形式的17 kD的胱冬肽酶3. 前胱冬肽酶3本身并没有催化活性, 在活化时首先由颗粒酶B或胱冬肽酶10在D175剪切下小片段后他才被部分活化, 随后则可进行下一步的自我催化. 已知颗粒酶B是丝氨酸蛋白酶, 能引起靶细胞DNA裂解、凋亡, 是CTL介导的凋亡的途径之一, (另一途径是Fas/FasL介导的), 目前认为颗粒酶B所致凋亡是通过裂解活化胱冬肽酶3而得以进行的[6].

凋亡在生物界是一种普遍现象, 他是多细胞生物进化过程中形成的、生命中必须的细胞死亡方式, 主要作用是清除无用的、多余的、不正常的、已完成任务的或有害的细胞, 维持机体内环境稳定．胱冬肽酶3在细胞凋亡中起着不可替代的作用, 胱冬肽酶3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡, 这个过程可以被Bcl-2阻断; 在发生凋亡的细胞提取液中去除胱冬肽酶3后, 这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力; 再加入纯化的胱冬肽酶3他就又恢复了致凋亡的功能.

胱冬肽酶3识别序列为DEVD, 可以与众多的底物作用, 从而引起细胞凋亡. 多聚ADP-核糖聚合酶 (PARP)是一种核蛋白, 其功能与DNA修复、基因组的维护和整合性, 及对环境刺激应力变化反应有关. 在细胞凋亡启动时, 116 kD的PARP在Asp216-Gly217之间被胱冬肽酶3剪切成31 kD和85 kD两个片段, 使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离, 不能发挥正常功能, 结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高, 裂解核小体间的DNA, 引起细胞凋亡. 这种裂解过程可被胱冬肽酶3的特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO所抑制, 但不能被CrmA抑制. 在很多形成凋亡的细胞中, 均可发现PARP这一片段, 因而, PARP是凋亡蛋白酶底物之一[7]. 胱冬肽酶3还可以剪切U1-70K、DNA-PK、PKCd和PKCq. PKCd和PKCq都属于新型PKC, 当被胱冬肽酶3剪切后, 可以切除调节区域, 而成为活性形式的PKC, 另外实验还证明, 过量表达PKCd 和PKCq 均可以引起细胞凋亡, 说明他们都参与了细胞凋亡的诱导. 胱冬肽酶3可以切开与DNA酶相连的抑制酶, 使前者激活, 入核后水解DNA[8], 产生电泳梯形. 胱冬肽酶3还可以切断肌凝蛋白, 后者是一种在正常情况下结合肌动蛋白丝, 保持细胞形状的蛋白, 将胱冬肽酶3切断的肌凝蛋白片段注入细胞, 细胞就会失去形状, 发生细胞凋亡样变化[9], 切断的肌凝蛋白可能是细胞凋亡发生期间形态变化的生理效应物.

2 慢性乙型肝炎病毒与胱冬肽酶3

近年来细胞凋亡在肝脏疾病发病机制中的作用越来越受到人们的重视, 重新认识了细胞凋亡在病毒性肝炎慢性化和肝细胞癌中的地位. 病毒感染时肝细胞的死亡可以是病毒直接作用或宿主免疫应答所致. 许多病毒感染所致的细胞凋亡与细胞毒作用有关, 如腺病毒、EB病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)等. 事实上, 病毒感染引起的细胞凋亡可能就是宿主通过细胞主动死亡来阻止(或延缓)受感染细胞内病毒复制和扩散, 而病毒也通过某种方式来阻止或延缓凋亡的发生使其成功地复制繁殖. 病毒产物抗凋亡机制可能有: (1)诱导p53失活; (2)使bcl-2和类bcl-2基因过度表达; (3)使胱冬肽酶家族成员失活.

慢性乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝DNA病毒属, 基因组全长约3.2 kb, 主要感染宿主肝细胞并导致一系列病理过程, 包括隐性感染到后期的HCC[10-12]. HBV在感染肝细胞早期抑制凋亡, 之后再激活凋亡以便自身的复制及传播, 这样, 对于凋亡的抑制或激活都可以使细胞发生恶性突变. 在使用抗Fas抗体刺激并且在HBx的存在下, 胱冬肽酶3的活性以及线粒体释放细胞色素 C受到了抑制[13]. Yano et al[14]研究了HBV相关性肝癌细胞中胱冬肽酶3的定量, 并运用免疫组化方法对胱冬肽酶3的活性进行了分析, 他们发现在肿瘤细胞中胱冬肽酶3的活性相对于正常细胞明显下降, 说明了HBV对于胱冬肽酶3活性有明显的抑制作用.

运用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)药理学抑制剂渥曼青霉素抑制PI3K活性可以介导细胞凋亡, 并且可以使生长因子抗凋亡效应丧失[15-17]. Gottlob et al[18]通过不同的细胞系来研究HBx蛋白与胱冬肽酶3的关系, 说明HBx蛋白可以抑制胱冬肽酶3的活性, 通过对氨基端和羧基端截短型HBx分子的研究说明其抗凋亡活性与已知的两个反式激活结构域有重叠. Lee et al[19]研究证实了PI3K的激活以及后来的Akt和Bad的激活在CHL细胞中产生了抗凋亡作用, 并且可以激活胱冬肽酶3的活性, 表明HBV通过HBx-PI3K-Akt-Bad途径来抑制胱冬肽酶3的活性, 从而抑制凋亡的产生. 表达HBx蛋白的CHL细胞可以对血清撤除介导的凋亡有明显的抑制作用, 转染了p53后, 这个效应仍然存在, 说明了HBx介导的抗凋亡作用至少是部分不依赖于p53的.

3 慢性丙型肝炎病毒与胱冬肽酶3

慢性丙型肝炎病毒(HCV)是导致以肝细胞炎症、损伤、纤维化为特征的肝脏疾病的主要因素之一[20-26]. 尽管目前尚不清楚胱冬肽酶家族在HCV致病过程中起什么样的作用, 但凋亡肯定涉及了其致病机制. Otsuka et al[27]研究了HCV核心蛋白对细胞凋亡的效应机制, 使用抗-Fas抗体刺激后, 核心蛋白抑制了凋亡的级联, 从下游的胱冬肽酶8到上游胱冬肽酶3, 从而说明了核心蛋白在线粒体水平抑制凋亡, 通过加强Bcl-x的表达而抑制了胱冬肽酶3的激活. 还有许多研究都报道了在HCV相关HCC患者的尸检中, 肿瘤细胞内胱冬肽酶3的活性都相当低, 这也可能是HCV致癌原因之一.

在HCV感染患者体内, CTL和辅助性T细胞是防止病毒持续存在的关键所在, 而HCV感染患者体内外周血中HCV特异性CTL的数量却非常少[28-29], Hahn et al[30]研究了HCV核心蛋白对T淋巴细胞的影响, 在人T细胞系Jurkat细胞中瞬时或稳定表达核心蛋白可以增加细胞对Fas介导的凋亡的敏感度, 并且观察到了核心蛋白可以与Fas胞内区结合, 而此结构域可以增加Fas介导凋亡的下游信号途径. 核心蛋白的表达并没有改变细胞表面Fas的表达, 说明了表达核心蛋白的细胞对于Fas配体的敏感性的增加并不依赖于Fas的下调, 进一步, 他们还观察到了在表达核心蛋白细胞内胱冬肽酶3的活性增加. 这些结果都说明在HCV感染阶段, 核心蛋白通过Fas信号途径激活了免疫细胞内胱冬肽酶3, 促进了免疫细胞的凋亡, 从而使其自身得以存活.

编辑: N/A

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