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世界华人消化杂志. 2004-02-15; 12(2): 393-397
在线出版日期: 2004-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i2.393
乙型肝炎病毒DNA 多聚酶P结构域研究进展
陈国凤, 成军, 王琳, 张玲霞, 李莉
陈国凤, 成军, 王琳, 张玲霞, 李莉, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. C39970674, No. C03011402, No. C39900130, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-07-12
修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 陈国凤, 成军, 王琳, 张玲霞, 李莉. 乙型肝炎病毒DNA 多聚酶P结构域研究进展. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 393-397
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: July 12, 2003
Revised: August 10, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004

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Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒属, 是一组以侵袭肝脏为主的病毒, 主要感染哺乳动物和鸟类. HBV DNA的长度为3. 2 kb, 具有4个开放读码框架(ORF), 分别编码HBV的表面抗原蛋白, 核心/e抗原蛋白, X蛋白以及HBV DNA多聚酶(HBVDNA P)[1]. HBV DNA P基因在ORF中最长, 并且与C、S、X基因区有重叠, 其编码的P蛋白含有N-末端蛋白(TP)、逆转录酶(RT)/DNA多聚酶、RNase H和隔离片(spacer, SP)等4个结构域, 各结构域分别位于2307-2840 nt、133-1128 nt、1129-1621 nt和2841-0-132 nt[2]. 目前对多聚酶及其所编码的各个结构域的研究取得了一定的进展.

1 多聚酶结构域的结构和功能

嗜肝病毒逆转录酶(多聚酶)含有的4个区域中, 末端蛋白和隔离片对嗜肝病毒多聚酶是独特的, 末端蛋白内的第96位酪氨酸残基可引导DNA合成, 并使多聚酶与病毒DNA共价结合, 隔离片无已知的功能, 只是将末端蛋白和其他分子连接起来, 逆转录酶和RNase H包含2个已知的酶活性位点, 后二者与其他相关的逆转录病毒和逆转录因子的多聚酶是一致的[3-6]. Lott et al用昆虫细胞同时感染独立表达核心蛋白和多聚酶的杆状病毒, 结果发现核心蛋白与多聚酶相互作用的几个特征: (1)核心蛋白与表达全长的多聚酶及多聚酶的TP、RT、RNase H每个区域共同沉淀; (2)核心蛋白的共同沉淀不依赖ε凸出环序列; (3)核心蛋白-多聚酶复合物在蔗糖梯度分析中作为完整的衣壳体移动. 为分辨核心蛋白识别多聚酶的必备的结构和序列, 用突变的核心蛋白, 如2-4个氨基酸插入或羧基端缺失突变, 观察与多聚酶的相互作用. 结果提示核壳体构成是必需的, 但对于同多聚酶相互作用是不够的, 多聚酶的TP和RT与核心蛋白的相互作用有不同需要. 为了解核心蛋白在多聚酶上的结合位点, 对一组多聚酶的TP和RT结构域的N-末端和C-末端缺失突变体与核心蛋白的相互作用进行观察, 至少检出多聚酶上的3个独立的核心蛋白结合位点[7]. Lin et al研究两个自然发生的HBV颗粒56和2-18, 核酸序列有98.7%的同源性, 但是复制效率不同. 转染到HepG2细胞后, 从56转染细胞的细胞内病毒核心颗粒分离出的HBV DNA明显高于2-18. 用功能域基因替代法研究二者复制效率差异的结构基础. 将2-18中的完整P基因和TP、SP、RT和RNase H 分别用56相应区域替代形成全长嵌合基因组. 细胞转染分析提示, 2-18的全部P基因组用56的P基因替代使病毒复制轻度增强. 惟一获得像56颗粒体的高复制效率的嵌合基因组是用56的RT替代2-18的RT的基因组. 在RT区域内, 2-18与56的氨基酸差异在617位(蛋氨酸对亮氨酸)、652位(丝氨酸对脯氨酸)、682位(缬氨酸对亮氨酸). 652位氨基酸上的点突变是这种复制效率差异的原因. HBV RT结构域的同源性模型研究提示652位氨基酸残基从脯氨酸到丝氨酸突变可能影响对模板-引物相互作用的HBV RT的构造, 导致多聚酶活性减弱[8]. Li et al在T7噬菌体启动子的调控下构建HBV多聚酶cDNA并在兔的网状细胞裂解液中表达, 组成一对转录翻译系统. 在指定位点的突变中进一步证实重组多聚酶cDNA产生3种产物: 全长蛋白(约94 kD), 内在的始动蛋白(约81 kD), N-末端蛋白(约40 kD). 体外表达的多聚酶具有蛋白引物的活性, 由体外32P标记的-dGTP全长多聚酶和TP引导的检测可得到证实[9]. Kim et al对人HBV多聚酶的N-末端或C-末端和DNA多聚酶的结构域同时缺失形成变异株, 并在大肠杆菌中表达, 经直链淀粉柱层析法纯化后, 其纯化蛋白的DNA依赖性DNA多聚酶活性与野毒株进行比较, 结果TP与SP缺失分别可以使酶活性减少到70%, 而RNase H缺失对多聚酶活性的影响要大于前二者. 单个RT或将其N-末端缺失仍能保持酶活性[10]. 将人的HBV多聚酶在兔网状细胞裂解系统中表达. 表达蛋白显示出DNA依赖性的DNA多聚酶活性, 在体外转录和翻译产生分子量大约100 kD的大蛋白. HBV DNA多聚酶pH 7.5和温度37 ℃时聚合反应最佳, 同时, 多聚酶活性需要有MnCl2、MgCl2((最好是MnCl2). 在75 mM NaCl 或100 mm KCl存在时活性较好(以75 mm NaCl 时更好)[11]. Miriam et al对澳大利亚鸭乙型肝炎病毒(AusDHBV)进行克隆和测序, 并与其他嗜肝病毒进行比较. 在澳大利亚DHBV及其他鸟类嗜肝病毒中包括3个与病毒复制有关的重要特征: (1) 69个nt粘端重叠区, 保持染色体组环状结构, 包含1对12 nt 顺式重叠序列DR1(2 541-2 552 nt)和DR2 (2 483-2 494 nt); (2)多聚腺苷酰信号序列(2 778-2 783 nt), 对终止病毒mRNA转录是必须的; (3)在多聚酶的TP内第96位酪氨酸残基, 是RNA衣壳体信号序列(称为ε)的结合位点, 在前基因组RNA内用于负链DNA合成. 20条已发表的鸟类嗜肝病毒比较发现, 在第500 nt部位(编码隔离片区)替代或缺失突变最常见, 前-S/S基因(1 290-1 793 nt) S段和前-C段(2 524-2 652 nt), 编码逆转录酶区域, 替代和缺失很罕见, 是迄今为止所有DHBV病毒中最保守的[12].

2 多聚酶与细胞因子

Hu et al认为HBV逆转录的过程通过独特的蛋白引导机制开始的. 病毒逆转录酶首先以他的RNA模板装配成核蛋白(RNP)复合物, 然后逆转录酶本身作为蛋白质引物开始DNA的合成. RNP形成和蛋白引导需要宿主细胞因子的辅助, 包括分子陪伴热休克蛋白90(HSP90). 研究发现: (1)通过构建两个迷你RT(miniRT)表达片段, pcDNA-miniRT1(miniRT1)将改建后的DHBV RT多肽的N-末端(1-17 aa), C-末端(734-786 aa), 隔离片(245-352 aa)切除; pcDNA-miniRT2 (miniRT2) 在miniRT1基础上将C-末端进一步截短(575-786 aa). MiniRT1含564个残基(野毒株786残基), MiniRT2含394残基. MiniRT1与野毒株RT一样具有蛋白引导功能, MiniRT2具有完整的ε结合的活性, 但是仅有极少的蛋白引导活性(为野毒株的1-5%). 这两个mini-RT蛋白含有与HSP90和p23相关的结合域. 再者, 同全长RT一样, 他们需要陪护蛋白进行ε结合和蛋白引导. HSP90能识别TP和RT域上的两个特异区域, 含有两个陪伴蛋白结合区域的截短逆转录酶(mini-RT)蛋白保留了全部的ε结合活性, 对RNP形成和蛋白引导是必要的; (2)在体外用高浓度的盐和非离子洗涤液使逆转录酶和细胞因子(HSP90)解离, 单独表达逆转录酶, 纯化的逆转录酶失去了ε结合和蛋白引导的功能. 但含有HSP90和ATP的网状细胞裂解液能恢复这种功能. 一种特殊的HSP90抑制剂, 在ε结合前加入, 能降低MiniRT1的蛋白引导活性. 然而, 如果ε已经与 mini-RT结合(在翻译反应时)后再加入, 则对蛋白引导无作用. 说明药物特异性的阻滞εRNA与mini-RT相互作用, 对DNA合成本身无作用. HSP90对RT与RNA的结合, 不仅起到建立的功能, 而且还有维护的功能; (3) 在RT合成过程中不需要HSP90, 但HSP90可激活转译后的RT. 在细菌中成功表达两个mini-RT蛋白并且用亲和素标记纯化. 用真核细胞提取液重构时, 纯化的RT蛋白具有特异的ε结合和蛋白引导活性. RT活性的重构是依赖ATP的过程和需要HSP90功能. 细菌没有功能性的真核细胞HSP90陪伴系统, 提示RT合成不需要HSP90, 只不过在转译后能激活RT[13]. 进一步研究证明HSP90的几个辅因子(cochaperone)在体外足以保持重组DHBV 逆转录酶的ε结合和蛋白引导活性, 维护重组逆转录酶活性需要HSP90、HSP70、HSP40、Hop/p60等4种蛋白, 逆转录酶被陪伴蛋白激活是一个动力学过程, 需要ATP水解和HSP90 ATP酶活性. HSP90 和HSP70是ATP酶, 在ATP结合和水解时易于折叠, HSP40能刺激HSP70的ATP酶活性和调节HSP70的伴护功能. p60能与HSP90 和HSP70结合, p23为小的酸性磷蛋白质, 与HSP90结合, 进一步提高重组动力学. 2个截短的迷你型DHBV RT与谷胱苷肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白GST-miniRT1和GST-miniRT2, 在大肠杆菌中表达并纯化, 另外还构建了有两个氨基酸替换而不能与εRNA结合的突变型MiniRT2/CA29和在RT的活性位点两个氨基酸替换(YMDD变成YMHA), 使RT 失去活性的MiniRT1/YMHA. 在重构蛋白引导反应中, 显示在兔的网状细胞裂解液中, 依靠HSP90的存在, GST-miniRT1在体外有强烈的蛋白引导活性. 用已知的HSP90陪伴联合体的组成成分代替兔的网状细胞裂解物, 刺激蛋白引导, 结果, HSP90、HSP70、Hop, 和Ydj1(HSP40), 在一起能重新组成蛋白引导反应, 单独或任何2个或3个蛋白组合几乎是无效的, 偶尔HSP70加Ydj1能微弱刺激蛋白引导反应, 但比4种相加效力小得多. 同时, 这种蛋白引导反应与陪伴蛋白浓度呈正相关. 4种纯化的陪伴蛋白重新组成的蛋白引导活性较网状细胞裂解物要低, 可能是二者动力学差异所致. 适当延长作用时间, 可以使陪伴蛋白的引导活性提高. 蛋白引导与RT的催化活性有关, miniRT1/YMHA因失去了活性位点的突变RT完全没有蛋白引导的作用[14]. Wang et al构建了在逆转录酶的C-末端截短的DHBV RT (DHBV mini-RT蛋白)具有全部的蛋白引导活性, 即第一个核苷共价结合到蛋白质(RT的脱氧核苷酸). 但没有任何DNA聚合作用. 另一个RT区域的短小序列特点是对逆转录酶的脱氧核苷酸是无关紧要的, 但对于DNA的聚合作用却是必不可少的. 这些结果揭示了蛋白引导的2个不同阶段, 即第1个核苷与RT(RT脱氧核苷酸或蛋白引导的起点)的首次接触, 和随后的DNA合成(聚合)成完整的蛋白引物. 用两个模型观察在蛋白引导反应中2个不同阶段对不同序列片段的要求. 体外蛋白引导反应时用 [α-32P]dATP标记核苷前体. MiniRT2的蛋白引导活性与MiniRT1相近. MiniRT2能与GTAA DNA寡聚体的第1个核苷(dGMP)共价结合, 说明能进行引导反应的第1步(dGMP与RT结合, 形成RT脱氧核苷酸), 但是不能与第2、第3个核苷dAMP结合, 也不能与第2个核苷TMP结合. 而MiniRT1的降解产物与 MiniRT2分子量大小相似者能与[α-32P]dGTP结合, 但与 [α-32P]dATP或[α-32P]TTP 仅有微量结合. 相反, MiniRT1的稍长一点的降解产物(介于MiniRT1和MiniRT2之间), 则可以与完整的MiniRT1一样, 能够与上述3种核苷结合. 用哺乳动物细胞纯化的MiniRT2与上述从细菌中纯化的MiniRT2在蛋白引导和反应条件方面相似. 构建另一条C-末端截短的RT片段, 其位置选在MiniRT1(734位aa)和MiniRT2(575位aa), 以便找出在蛋白引导反应中对DNA聚合是重要的(而对开始是无关紧要的)序列. 切断位点选在PmlI 酶切位点(661位aa), 仍能保证相当量的 dGTP和dATP 结合, 提示RT的C-末端125个氨基酸(661-786 aa)对蛋白引导反应无影响, 而557-661的81个氨基酸序列可能为蛋白引导的开始阶段向聚合阶段转变所必需. TP、RT和RNA 之间特殊的相互作用对嗜肝病毒的pgRNA包装是非常重要的, 同时需要C-末端RNase H域. 蛋白-蛋白、蛋白-RNA之间相互作用需要RNA包装可能强调TP-RT-RNA 之间相互制约[6]. Cho et al认为HSP90及其相关产物在DHBV感染通过RNA信号ε与DHBV多聚酶结合对DHBV复制起重要作用. 同理, 用兔网状细胞裂解液中合成人HBV多聚酶蛋白在体外与HSP90形成联合体, HSP90 用MBP共纯化, 多聚酶蛋白在HepG2细胞中表达, 提示在体内人的HBV多聚酶与HSP90相关. 为了对HSP90的作用位点进行定位, HBV多聚酶翻译的几个缺失突变与抗HSP90抗体在体外共沉淀, 结果提示TP的C-末端和RT单独与HSP90发生作用[15]. Cho et al研究显示HBV多聚酶单独与HSP90的N-末端和C-末端相互作用, HSP90的N-末端片段(1-302 aa)与HBV多聚酶的TP和RP都有相互作用, 而C-末端片段(438-723 aa)仅与RT相互作用, 其中间片段(327-438 aa)则与HBV多聚酶无相互作用[16]. Gyoo et al证明HSP90可以被抗-HSP90抗体抑制; 在体外HSP90被含有1%NP-40的1M NaCl解吸后几乎完全失去了对在昆虫细胞内表达的HBV多聚酶的引导活性. 人HBV多聚酶与前基因组RNA结合与鸭HBV多聚酶不同, HSP90不仅维持人HBV多聚酶与前基因组RNA结合的联合体, 而且使HBV多聚酶能胜任在体外引导作用. HSP70是HSP90 联合体组成成分, 但HSP70可能直接与HBV多聚酶结合不需要HSP90参与[17]. Park et al构建了杆状病毒载体pFPolE, 编码人HBV多聚酶开放读码框架(ORF)和3'-非翻译区(NTR)含有DR2、DR1和ε凸出环, ε凸出环对引导HBV复制起模板作用. 构建的含HBV 多聚酶的重组质粒经M2琼脂珠纯化, SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染后, 可得一条约60 kD的蛋白质带, 经N-末端氨基酸测序并经BLAST程序进行同源性分析, 然后进行免疫斑点分析和体外引导试验, 结果提示陪伴蛋白(chaperonin) HSP60与HBV P之间有特异性的相互作用关系. HSP60与HBV多聚酶相互作用, 是使HBV多聚酶变成活性状态的重要阶段. HSP60在体外强烈影响HBV多聚酶活性: (1)通过蛋白特异性抗体封闭HSP60, 可降低HBV多聚酶活性; (2)在ATP存在的情况下增加HSP60, 可提高多聚酶活性; (3)ATP与HSP60共同激活HBV多聚酶. 体内试验显示, 通过C△540(变异的HSP60)抑制细胞内的HSP60, 可导致HBV多聚酶活性的降低. 因此, HSP60与HBV多聚酶相互作用对激活HBV多聚酶是有明显意义的[18]. 进一步在昆虫细胞中使用重组杆状病毒表达多聚酶的几个缺失突变的蛋白质, 然后用M2免疫共沉淀, 显示HSP60结合到HBV P需要两个在P上的最小位点: TP(aa1-199)和RH(680-842 aa). 在人的HBV宿主细胞HepG2中显示HBV P也可以与HSP60结合; HSP60通过与TP和RH位点结合激活HBV P, 而P与HSP60结合不需要前基因组RNA[19]. Wang et al发现HSP90的靶蛋白从类固醇受体和蛋白激酶到逆转录酶, 这些蛋白之间从结构到功能均无相似之处. 用PropSearch软件分析, 发现RT与丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶c-Raf在氨基酸组成上高度相似. 丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸-蛋白激酶(CDK4和v-Src)是HSP90的靶蛋白, p50(CDC37)是HSP90的辅因子, p50能与这些激酶和HSP90特异结合. 发现p50/CDC37能在体内及体外与RT特异性相互作用. 其意义在于p50/CDC37能调节RT的体外蛋白引导活性和在转染细胞中RNA包装和DNA合成活性. 证明p50/CDC37是宿主细胞进行嗜肝病毒复制时的辅因子. 在细菌中表达并纯化的GST-MiniRT蛋白用结合到单抗M2珠上的纯化的p50 孵化, 结果, GST-MiniRT1和GST-MiniRT2能直接与p50和p50C(变异的p50)结合, 提示, DHBV RT能在体外直接与p50结合, 不需要HSP90或其他细胞因子参与. 细胞内试验也提示, mini-RT蛋白和TP在没有HSP90的情况下直接与p50结合[3].

3 多聚酶结构域与抗病毒治疗

全球有3亿以上人口成为HBV的慢性携带者, HBV感染是一个严重的公共健康问题. 慢性HBV携带的最大危害是发展为肝硬化和肝癌[13,20-25]. 核苷类似物如拉米夫定等是目前效果较好的抗病毒治疗制剂, 但长期抗病毒治疗(大于6 mo)可引起病毒变异, 病情反复, 甚至病情急剧加重, 导致死亡[26-29]. 最常见的病毒变异为多聚酶结构域的(YMDD)的第204位蛋氨酸被异亮氨酸取代(M204I)(ATG→ATT)成为YIDD, 或蛋氨酸被缬氨酸取代(M204V)成为YVDD [4,26-27], 其他病毒变异还有426位亮氨酸被异亮氨酸取代(L426I)和550位蛋氨酸被异亮氨酸取代(M550I), 以及L528M, M552V, M552I[28]变异, L526M、M550V、M550I[29]等. 因此, 掌握抗病毒治疗和停药的正确时机, 克服病毒变异是提高治疗成功率的关键.

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