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世界华人消化杂志. 2004-02-15; 12(2): 391-393
在线出版日期: 2004-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i2.391
乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白研究进展
陈国凤, 成军, 张玲霞, 李莉
陈国凤, 成军, 张玲霞, 李莉, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-07-12
修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15

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关键词: N/A
引文著录: 陈国凤, 成军, 张玲霞, 李莉. 乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白研究进展. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 391-393
N/A
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Correspondence to: N/A
Received: July 12, 2003
Revised: August 10, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004

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Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种, HBV DNA的长度为3.2 kb, 具有4个开放读码框架(ORF), 分别编码HBV的表面抗原蛋白, 核心/e抗原蛋白、X蛋白以及HBV DNA聚合酶(HBV DNA P)[1]. HBV DNA P基因在ORF中最长, 并且与C、S、X基因区有重叠, 其编码的P蛋白含有3个功能域和1个无意义的隔离片(spacer, SP), 排列顺序为N-末端蛋白(TP), 隔离片, RT/DNA聚合酶和RNase H. 由于受到不能从病毒体直接纯化和在不同的系统中表达有活性酶的限制, 目前对聚合酶及其所编码的各个功能区域蛋白质的功能的认识还不是很清楚.

1 末端蛋白的结构和功能

HBV DNA P基因编码TP、RT、RNase H和隔离片, 各区段分别在2 307-2 840 nt、133-1 128 nt、1 129-1 621 nt和2 841-0-132 nt[2]. Li et al在T7噬菌体启动子的调控下构建HBV聚合酶cDNA并在兔的网状细胞裂解液中表达, 组成一对转录翻译系统. 在指定位点的突变中进一步证实重组聚合酶cDNA产生3种产物: 全长蛋白(约94 kD), 内在的始动蛋白(约81 kD), N-TP(约40 kD). 体外表达的聚合酶具有蛋白引物的活性, 由体外32P标记的-dGTP全长聚合酶和TP引导的检测可得到证实[3]. Kim et al[4]对人HBV聚合酶的N-末端或C-末端和DNA聚合酶的结构域同时删除, 并在大肠杆菌中表达, 经直链淀粉柱层析法纯化后, 其纯化蛋白的DNA依赖性DNA聚合酶活性与野毒株进行比较, 证明TP和SP删除分别可以使酶活性减少到70%, 而RNase H删除对聚合酶活性的影响要大于前二者. 单纯RT或将RT的N末端删除后仍能保持聚合酶活性. 将人的HBV聚合酶在兔网状细胞裂解系统中表达, 表达蛋白显示出DNA依赖性的DNA聚合酶活性, 在体外转录和翻译产生分子量大约100 kD的大蛋白. HBV DNA聚合酶可以被阿菲迪霉素(抗病毒抗生素)和NEM抑制, 在pH7.5和温度37 ℃时聚合反应最佳, 同时, 聚合酶活性需要有MnCl2或 MgCl2 (在MnCl2 时更佳). 在75 mm NaCl 或100 mm KCl存在时活性较好(75 mm NaCl 时活性更佳). 对聚合酶蛋白删除后的聚合活性研究显示, TP对于完整的聚合酶功能是必要的, 隔离片删除可能降低P蛋白的稳定性[5]. Miriam et al[6]对澳大利亚鸭乙型肝炎病毒(AusDHBV)进行克隆和测序, 并与其他嗜肝病毒进行比较. 在澳大利亚DHBV及其他鸟类嗜肝病毒中包括3个与病毒复制有关的重要特征: (1)69个nt粘端重叠区, 保持染色体组环状结构, 包含1对12 nt 顺式重叠序列DR1(2 541-2 552 nt)和DR2(2 483-2 494 nt). (2)多聚腺苷酰信号序列(2 778-2 783 nt), 对终止病毒mRNA转录是必须的. (3)在聚合酶的TP内第96位酪氨酸残基, 是RNA衣壳体信号序列(称为ε)的结合位点, 在前基因组RNA内用于负链DNA合成. 20条已发表的鸟类嗜肝病毒比较发现, 在第500 nt部位(编码隔离片区)替代或删除突变最常见, 前-S/S基因(1 290-1 793 nt)S段和前-C段(2 524-2 652 nt), 编码RT区域, 替代和缺失很罕见, 是迄今为止所有DHBV病毒中最保守的. 嗜肝病毒RT含有的4个区域中, TP和隔离片对嗜肝病毒聚合酶是独特的, TP内的第96位酪氨酸残基可引导DNA合成, 并使聚合酶与病毒DNA共价结合, 隔离片无已知的功能, 只是将TP和其他分子连接起来, RT和RNase H包含两个已知的酶活性位点, 后二者与其他相关的逆转录病毒和聚合酶是一致的[7-18].

2 末端蛋白与HBV复制

HBV含3.2 kb碱基部分双链DNA基因组, 是由3.5 kb前基因组病毒转录的逆转录核壳包裹形成的. 病毒复制的第一步是HBV聚合酶识别5'-末端的前基因组RNA的核壳包裹信号ε. 利用ε的茎-环(stem-loop)结构域为模板, 聚合酶的TP域的酪氨酸残基为引物, 使聚合酶与前基因组RNA结合, 在RT作用下, 病毒RNA转化为DNA[19]. Beck et al[20]利用在兔的网状细胞裂解液(RRL)中, 产生DHBV DNA P蛋白的翻译复合物, 并且为克服该系统翻译能力有限, 影响对复合物进一步分析的缺点. 先在大肠杆菌内表达产生大量DHBV DNA P蛋白, 然后在RRL中的进行核蛋白复合物的重构. 因为以往在细菌中产生全长P蛋白的尝试没有成功, 于是单独在大肠杆菌中表达TP和RT-RNase H(RT-RH). 结果, TP和C-末端经微小修改后的RT-RH, 也能有相当量的表达, 当加入到RRL时, 能进行ε-依赖性DNA引物合成, 证明翻译后的活化. Yao et al[21]发现75% DHBV RT在转染LMH细胞中不是按已知的途径, 而是在细胞中与核心蛋白或核壳体分开存在. 在感染的鸭肝中, 未被核壳包裹的RT也是大量存在的, 他们作为亚型的序列联合体, 最易在转译后修正产生. 仅有极少的亚型被核壳包裹成病毒核心颗粒, 没有被核壳包裹的RT大量存在于感染的鸭肝内, 以复合物的形式存在于细胞质中. RT在结构上仅有部分与核心蛋白重叠, 这种结构不受封闭的壳体的影响. 这提出了RT可能的代谢作用是转译后被调节, RT在复制周期中的作用可能比已知的要多.

嗜肝病毒(HBV)RT与前基因组RNA模板上的RNA信号ε的特异结合, 并且靠RT自身引导(蛋白引导). 蛋白引导不仅需要病毒RT和εRNA 模板, 也需要特异的宿主细胞因子(细胞蛋白), 包括热休克蛋白Hsp90, 多种分子伴侣(cochaperone)蛋白, 还有一些不清楚的成分共同组成的核蛋白复合物. 有功能的复合物催化合成短链DNA引物, 该引物又作为ε与TP共价结合的模板. Cho et al认为HSP90及其相关产物在DHBV感染通过RNA信号ε与DHBV聚合酶结合对DHBV复制起重要作用. 同理, 用兔网状细胞裂解液中合成人HBV聚合酶蛋白在体外与HSP90形成联合体, HSP90 用MBP共纯化, 聚合酶蛋白在HepG2细胞中表达, 提示在体内人的HBV聚合酶与HSP90相关. 为了对HSP90的作用位点进行定位, HBV聚合酶翻译的几个删除突变与抗HSP90抗体在体外共沉淀, 结果提示TP的C末端和RT单独与HSP90发生作用[22]. Cho et al[23]研究显示HBV聚合酶单独与Hsp90的N末端和C末端相互作用, Hsp90的N末端片段(1-302 aa)与HBV聚合酶的TP和RP都有相互作用, 而C末端片段(438-723 aa)仅与RT相互作用, 其中间片段(327-438 aa)则与HBV聚合酶无相互作用. Hu et al[24]研究证明DHBV RT需要宿主细胞因子的辅助进行RT与ε的特异结合和蛋白引导功能. RT与ε交互作用和蛋白引导需要Hsp90. Hsp90的几个辅因子在体外足以保持重组RT活性, 与ε结合和蛋白引导. Hsp90、Hsp70、Hsp40、Hop/p60和p23均为细胞因子, Hsp90 和Hsp70是ATP酶, 在ATP结合和水解时易于折叠, Hsp40能刺激Hsp70的ATP酶活性和调节Hsp70的陪伴功能. P60能与Hsp90 和Hsp70结合, p23, 为小的、酸性磷蛋白质, 与Hsp90结合, 进一步提高重组动力学. RT被分子伴侣蛋白活化后是一个动力学过程, 依赖ATP水解和Hsp90 ATP酶活性. 两个截短的迷你型DHBV RT融合蛋白GST-mini-RT1和GST-miniRT2在大肠杆菌中表达并纯化, 另外还构建了不能与εRNA结合的RT突变型Mini-RT2/CA29, 无活性的RT Mini-RT1/YMHA. 经过对蛋白引导反应和RNA结合试验, 结果, Hsp90、Hsp70、Hop、Ydj1(Hsp40)在一起能重新组成蛋白引导反应, 单独或任何两个或三个蛋白组合是无效的, 偶尔Hsp70加Ydj1能微弱刺激蛋白引导反应, 但比4种相加效力小得多. 同时, 这种蛋白引导反应与陪伴蛋白浓度呈正相关. 与RT的催化活性有关, 对失去了活性位点的突变RT完全没有蛋白引导的作用. Gyoo et al证明Hsp90可以被抗-Hsp90抗体抑制; 在体外Hsp90被含有1% NP-40的1 M氯化钠解吸后几乎完全失去了对在昆虫细胞内表达的HBV聚合酶的引导活性. Hsp90 不仅维持人HBV聚合酶与前基因组RNA结合的联合体, 而且使HBV聚合酶能胜任在体外引导作用. Hsp70是Hsp90 联合体组成成分, 但Hsp70可能直接与HBV聚合酶结合不需要Hsp90参与[25].

Park et al[26]构建了杆状病毒载体pFPolE, 编码人HBV聚合酶开放读码框架(ORF)和3'-非翻译区(NTR)含有DR2、DR1和ε环, ε环对引导HBV复制起模板作用. 构建的含HBV 聚合酶的重组质粒经M2琼脂珠纯化, SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染后, 可得一条约60 kD蛋白带, 经N末端氨基酸测序并经BLAST程序进行同源性分析, 然后进行免疫斑点分析和体外引导试验, 结果提示分子伴侣蛋白Hsp60与HBV Pol之间有特异性的相互作用关系. Hsp60与HBV聚合酶相互作用, 是使HBV聚合酶变成活性状态的重要阶段. Hsp60在体外强烈影响HBV聚合酶活性: (1) 通过蛋白特异性抗体封闭Hsp60, 可降低HBV聚合酶活性; (2) 通过增加ATP中的Hsp60, 可提高聚合酶活性; (3)ATP与Hsp60共同激活HBV聚合酶. 体外试验显示, 通过C△540 (变异的Hsp60)可抑制细胞内的Hsp60, 可导致HBV聚合酶活性的降低. 因此, Hsp60与HBV聚合酶相互作用对激活HBV聚合酶有明显意义. 进一步在昆虫细胞中使用重组杆状病毒表达聚合酶的几个缺失突变的蛋白质, 然后用M2免疫共沉淀, 显示Hsp60结合到HBV P需要两个最小位点: TP(1-199 aa)和RH(680-842 aa). 在人的HBV宿主细胞HepG2中显示HBV P也可以与Hsp60结合; Hsp60通过与TP和RH位点结合激活HBV P, 而HBV P与Hsp60结合不需要前基因组RNA[27].

Wang et al将C末端切断后的Mini-RT2中去掉N末端和隔离片后形成RT变异体, 观察其结合dATP的情况, 结果, RT变异体能够完成与dGPT的结合, 但不能与dATP结合. TP和RT之间相互作用与其他病毒的蛋白引物和独立的DNA聚合酶残基有着重要差异. TP、RT和εRNA 之间特殊的相互作用对嗜肝病毒的pgRNA包装是非常重要的, 同时需要C末端RNase H域. 蛋白-蛋白, 蛋白-RNA之间相互作用需要RNA包装可能强调TP-RT-εRNA 之间相互制约[18].

3 TP与单克隆抗体

Jasper et al用重组的人HBV聚合酶(HBV P)在感染了杆状病毒的昆虫细胞内表达并纯化产生了6个对HBV P蛋白的单克隆抗体(单抗). 单抗1B4、7C3和10B9识别聚合酶TP的20-30 aa抗原决定基, 单抗2C8识别TP的8-20氨基酸抗原决定基, 单抗8D5识别隔离片的225-250 aa抗原决定基, 单抗9F9识别RNase H的800-832 aa抗原决定基. 鼠的B细胞HBV P抗原决定基显0示被定位在N-和C-末端蛋白和隔离片区域. Western blot和免疫沉淀法示: 已知单抗与聚合酶的N末端结合, 阳性对照M2识别全长的聚合酶和含有N末端的降解产物, 1B4、2C8、7C3识别聚合酶N末端抗原决定基. 8D5识别隔离片区, 9F9识别聚合酶C-末端的抗原决定基. 能够免疫沉淀聚合酶的所有聚合酶单克隆抗体均经体外引导抑制试验, 了解他们在体外抑制引导酶活性的作用. 考马斯亮蓝染蛋白胶显示在不同的单抗中聚合酶沉淀的量. M2单抗作为免疫沉淀和体外引导的阳性对照. C7-57为阴性对照. 结果, 单抗9F9无引导活性抑制, 2C8的86%体外引导活性被抑制. 8D5的14%被抑制, 等量的1B4和7C3分别有98%和81%被抑制. 提示TP特异的单抗能抑制聚合酶的体外引导活性. 在体外引导测试中, 只有对TP特异的单抗, 显示对聚合酶功能有抑制作用. 提示, 抗体介导的对TP的干扰可能用于检测HBV复制. 进一步研究出能干扰聚合酶功能的单抗, 对研究抗HBV复制的制剂可能有意义[17].

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