达纳康对大鼠溃疡性结肠炎细胞因子的影响

摘要

目的: 观察大鼠实验性溃疡性结肠炎脾淋巴细胞, 肠组织和血清中, 细胞因子的表达及达纳康对其的影响, 探讨达纳康对溃疡性结肠炎的保护作用及其机制.

方法: 用三硝基苯磺酸(TNBS)建立大鼠溃疡性结肠炎模型. 将动物随机分为空白对照组、三硝基苯磺酸、三硝基苯磺酸+生理盐水组、三硝基苯磺酸+达纳康组四组观察肠道大体形态和组织学改变. 采用ELISA法测定脾细胞、大肠黏膜及血清中的白介素-12(IL-12)、干扰素α(IFN-α)和白介素4 (IL-4).

结果: 与三硝基苯磺酸组比较三硝基苯磺酸+达纳康损伤指数明显下降(2.83±0.94 vs 5.33±1.50, P<0.01, 1.92±0.67 vs 4.33±0.98, P<0.01). IFN-α浓度明显下降. 脾细胞: 60±21.5 vs 125.6±14.6, P<0.01大肠黏膜: 202.8±49.6 vs 431.8±57.6, P<0.01血清: 8.6±1.4 vs 13.5±1.7, P<0.01. 与模型组比较TNBS组+EGb组IL-4浓度明显升高(脾细胞: 11.2±1.3 vs 6.05±1.5, P<0.01大肠黏膜: 10.2±1.9 vs 6.9±1.4, P <0.01血清: 7.9±1.8 vs 4.2±1.1, P<0.01). 血清IL-12浓度明显下降(8.2±2.2 vs 25.8±4.8, P <0.01)血清IL-12/IL-4比值下降(1.13±0.49 vs 6.4±1.8, P<0.01). IFN-α/IL-4比值明显下降 (脾细胞: 5.2±2.0 vs 21.9±4.9, P<0.01, 大肠黏膜: 20.9±7.97 vs 65.9±18, P<0.01; 血清: 1.1±0.3 vs 3.4±0.8, P<0.01).

结论: TNBS诱导的大鼠UC模型是Th1(IL-12)亚型为主的免疫应答反应, EGb通过抑制IL-12, IFN-α生成, 恢复Th1/Th2细胞因子的平衡, 发挥对溃疡性结肠炎的保护作用.

关键词: N/A

Effects of Ginkgo biloba extract on cytokines in rats with TNBS-induced ulcerative colitis

Yan-Hong Zhou, Jie-Ping Yu, Xiao-Fei He, Xi-Qiu Yu

Yan-Hong Zhou, Jie-Ping Yu, Xi-Qiu Yu, Department of Gastroenterology, Wuhan University Renmin Hospital, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Xiao-Fei He, Department of Gasroenterology, The Affiliated Hospital, Xianning Medical College, Xianning 437100, Hubei Province, China

Correspondence to: Dr. Xiao-Fei He, Department of Gasroenterology, Xianning Medical College, Xianning 437100, Hubei Province, China. doctorhe120@hotmail.com

Received: September 9, 2003
Revised: October 10, 2003
Accepted: November 6, 2003
Published online: February 15, 2004

Abstract

AIM: To investigate the effects of Ginkgo biloba extract (Egb) on cytokine profile produced by splenocytes, colonic mucosa and serum and to study the main mechanism of EGb in protection of TNBS-induced ulcerative colitis in rats.

METHODS: A rat ulcerative colitis model was induced by 2.4.6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS). All rats were divided into four groups: normal, TNBS, TNBS+NS, and TNBS+EGb. The macroscopical and histological changes of the colon were evaluated. The IL-12, IFN-α and IL-4 produced by splenocytes, colonic mulosal and serum were analyzed with ELISA.

RESULTS: In TNBS+EGb group, the macroscopical and histological scores were significantly lower than those of TNBS group (2.83±0.94 vs 5.33±1.50, P < 0.01, 1.92±0.67 vs 4.33±0.98, P < 0.01). In the TNBS+EGb group, a lower level of IFN-α production in splenocytes (60±21.5 vs 125.6±14.6, P < 0.01); colonic mucosa (202.8±49.6 vs 431.8±57.6, P < 0.01) and serum (8.6±1.4 vs 13.5±1.7, P < 0.01) was noticed as compared with TNBS group. In comparison with TNBS group, significantly increased IL-4 was noticed (splenocytes: 11.2±1.3 vs 6.05±1.5, P < 0.01; colonic mucosa: 10.2±1.9 vs 6.9±1.4, P < 0.01; serum: 7.9±1.8 vs 4.2±1.1, P < 0.01) in TNBS+EGb group. IL-12 production by serum in TNBS+EGb group was lower than that of TNBS group (8.2±2.2 vs 25.8±4.8, P < 0.01). The ratio of IL-12/IL-4 was lower in TNBS+EGb group compared with TNBS group (serum: 1.13±0.49 vs 6.4±1.8, P < 0.01). The ratio of IL-12/IL-4 was lower than that in TNBS+EGb group compared with TNBS group (splenocytes: 5.2±2.0 vs 21.9±4.9, P < 0.01; colonic mucosa: 20.9±7.97 vs 65.9±18, P < 0.01; serum: 1.1±0.3 vs 3.4±0.8, P < 0.01).

CONCLUSION: TNBS-induced ulceratived colitis is a Th1 type dominant (IL-12 overproduction)murine model; EGb has protective effects on ulcerative colitis of rat by suppresses of increased IL-12 and IFN-α and maintaines the balance of helper T cell 1 with helper T cell 2.

Key Words: N/A

0 引言

炎症性肠病 (IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD). 是病因和发病机制未确定的慢性非特异性胃肠道炎症性疾病[1-3]. 发病机制复杂, 与遗传易感性, 免疫调节紊乱, 环境等多因素有关[4]. 越来越多的研究表明免疫因素是其最基本的发病机制[5]. 近来对细胞因子的研究对探讨UC的病因, 发病机制, 治疗具有重要的现实意义[6-11]. 如促炎性细胞因子与抗炎细胞因子间的平衡失调被视为IBD的一个重要发病机制[12-13].

达纳康是银杏叶标准化萃取物, 具有消除氧自由基, 增强抗氧酶活性, 抑制脂质过氧化, 减轻氧自由基对ATP酶的攻击, 解除红细胞聚集作用和拮抗血小板聚集活化因子, 改善微循环等作用[14]. 有可能对大鼠UC细胞因子有一定影响. 我们用达纳康灌胃来治疗溃疡性结肠炎, 观察其对大鼠UC中细胞因子的影响, 探讨达纳康的免疫药理作用.

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级健康♂SD大鼠48只(180±20 g). 购于武汉大学医学院动物中心; 2.4.6-三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma); EGb为贵州信邦制药股份有限公司生产. SOD、MDA试剂盒购于南京建成生物工程公司. 大鼠IL-4和IFN-α检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供, 大鼠IL-12检测试剂盒, 购自法国IMMUNDTECH公司. 其他试剂为进口或国产分析纯.

1.2 方法

将48只动物随机分为空白对照组(Normal group), 三硝基苯磺酸组(TNBS group), 三硝基苯磺酸+生理盐水组(TNBS+NS group)三硝基苯磺酸+达纳康组(TNBS+EGb group) 4组, 空白对照组12只不作任何处理. 实验组大鼠术前禁食24 h, 自由饮水, 造模时乙醚麻醉大鼠后用一直径2.0 mm, 长约12 cm的硅胶管由肛门轻缓插入深约8 cm, 三硝基苯磺酸组以含150 mg/kg TNBS的50%乙醇溶液缓慢推入结肠, 诱导UC形成[15]. 为确保注入之TNBS能够在大肠内弥散分布, 注入后将大鼠尾巴提起, 持续倒置30 s. 三硝基苯磺酸+生理盐水组12只, TNBS处理同上, 同时以2 mL/只的0.9%生理盐水溶液灌胃, 1次/d. 三硝基苯磺酸+达纳康组12只, TNBS处理同上, 同时给予EGb, 用生理盐水配成1.0 g/kg灌胃, 1次/d. 三硝基苯磺酸组建立3 wk后处死动物, 三硝基苯磺酸+生理盐水组和三硝基苯磺酸+达纳康组6 wk后处死动物, 取肛门至盲肠段结肠(约8 cm)沿肠结膜纵轴剪开, 冷生理盐水冲洗干净, 肉眼进行大体形态评分. 取肠组织一部分以4.0%多聚甲醛固定, 石蜡包埋, 连续切片, HE染色镜下评价炎症和溃疡, 结肠组织损伤大体形态和组织学形态评分方法[16-17] : 大体形态损伤评分指标包括粘连局部充血, 溃疡形成及炎症, 按有无、轻、重分别计0、1、2分, 溃疡或/和炎症大于2 cm, 病变范围每增加1 cm, 计分加1分. 组织学损伤评分指标包括溃疡炎症肉芽肿, 纤维化按有无及轻重计为0、1、2分, 病变深度(达黏膜下层1分、肌层2分、浆膜层3分), 各项相加得总分.

1.2.1 麻醉大鼠后, 腹腔静脉采血4 ml左右, 置无菌试管中, 室温静置自然凝固收缩后, 于37 ℃水浴中, 孵育20 min, 以4 000 r/min离心10 min, 分离血清, 保存于-20℃冰箱, 进行ELISA检测.

1.2.2 处死大鼠后迅即取出脾脏, 置于40 μm网目的细胞筛上用试管将脾脏磨碎, 冷PBS冲洗, 取100目尼龙网过滤, 至50 ml离心管中, 3 000 r/min离心 5 min后, 用含10% FBS的RPMI1640营养液, 重复洗涤3次, 3 000 r/min离心, 用含10% FBS的RPMI1640营养液6 ml重悬, 用台盼蓝测细胞活性大于95%, 调整细胞计数, 1×10⁶/ml的浓度, 于37 ℃ 5% CO₂条件下培养48 h, 取上清液-70 ℃冻存待用.

1.2.3 大鼠处死后即取炎症改变最明显处的结肠组织 (1 g左右)在2-5 ml冰冷的PBS液中除去血液, 滤纸拭干, 称湿重. 再以PBS液清洗3次后以含10% FBS(灭活小牛血清)青链霉素(各100 u/ml)的RPMI1640组织培养液清洗3次接种入48孔培养板中, 每孔加入400 μl培养液浸没组织块在5% CO₂ 37 ℃条件下无菌培养48 h, 收集上清液分装4个EP管于-70 ℃保存待用. 采用ELISA试剂盒检测培养上清液中的IL-4、IFN-α的含量, 按照说明书进行操作, 用酶标仪(BIO-TCK/USA)进行检测.

结果判断: 根据标准品不同浓度A值绘制标准曲线, 通过标本的A值在标准曲线上查出其浓度, 除以组织湿重, 即为该样品的局部细胞因子水平[18-19].

统计学处理 实验数据以mean±SD表示, 采用单因素方差分析处理, 以P<0.01为有统计学意义.

2 结果

2.1 肠组织大体形态组织学损伤评分结果

对照组无腹泻, 黏膜光滑无溃疡, 腺体排列整齐. 各用药组大鼠在灌肠后24 h见懒动、厌食, 腹泻, 多为不成形稀便, 可持续3 wk以上. 3 wk后处死动物, 三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组, 可见结肠与周围组织粘连伴近端肠腔扩张, 黏膜充血水肿, 溃疡形成, 肠道于病变部位出现狭窄, 光镜下可见溃疡及炎性渗出物, 主要表现为中性粒细胞浸润, 可见数量不等的单个核细胞和嗜酸性粒细胞, 也可见增生的纤维母细胞, 且出现黏膜腺体排列变形. 大体形态评分和组织学评分明显增高(P<0.01)见表1、图1. 三硝基苯磺酸+达纳康组, 可见黏膜充血水肿较轻, 可见正在愈合的溃疡, 结肠结构基本正常, 大体形态评分和组织学损伤评分减低(P<0.01)见表1、图2.

表1 各组大鼠大体形态组织学损伤评分(mean±SD).

分组	大体形态评分	组织学评分
Normal 组	0.58±0.51	0.67±0.49
TNBS 组	5.33±1.50b	4.33±0.98b
TNBS + NS组	4.58±1.16b	3.67±0.78b
TNBS + EGb组	2.83±0.94df	1.92±0.67df

^bP<0.01 vs Normal;

^dP<0.01 vs TNBS组;

^fP<0.01 vs TNBS+NS组.

图1 大鼠UC肠组织炎性浸润, 溃疡形成(HE染色200×).

图2 大鼠达纳康组溃疡愈合(HE染色200×).

2.2 IFN-α浓度

三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组较空白对照组, 脾细胞, 血清和大肠黏膜, IFN-α浓度显著升高(P<0.01, 表2). 而三硝基苯磺酸+达纳康组较三硝基苯磺酸组与三硝基苯磺酸+生理盐水组血清、脾细胞、大肠黏膜生成IFN-α量明显下降(P<0.01, 表2). 三硝基苯磺酸组与三硝基苯磺酸+生理盐水组中脾细胞, 大肠黏膜, 血清IFN-α浓度无明显改变.

表2 大鼠IFN-α浓度(pg/ml)的比较(mean±SD).

	脾淋巴细胞	血清	大肠黏膜
Normal	78.7±9	6.08±1.9	195.2±46.5
TNBS	125.6±14.6b	13.5±1.7b	431.8±57.6b
TNBS+NS	107.8±15.9b	10.9±1.7b	385.2±58.4b
TNBS+EGb	60±21.5df	8.6±1.4df	202.8±49.6df

^bP<0.01 vs Normal;

^dP<0.01 vs TNBS组;

^fP<0.01 vs TNBS+NS组.

2.3 IL-4浓度

三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组较空白对照组, 脾细胞, 血清和大肠黏膜中较空白对照组脾细胞, 血清和大肠黏膜中IL-4生成呈明显下降(P<0.01, 表3). 而三硝基苯磺酸+达纳康组较三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组中脾细胞, 血清和大肠黏膜中IL-4生成呈明显升高(P<0.01, 表3). 三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组中脾细胞、大肠黏膜、血清生成IL-4无明显改变.

表3 大鼠IL-4浓度(pg/ml)的比较(mean±SD).

	脾淋巴细胞	血清	大肠黏膜
Normal	14.3±1.6	8.0±1.3	12.6±1.0
TNBS	6.0±1.5b	4.2±1.1b	6.9±1.4b
TNBS+NS	6.8±1.54b	5.8±1.0b	8.0±0.9b
TNBS+EGb	11.2±1.3df	7.9±1.8df	10.2±1.9df

^bP<0.01 vs Normal;

^dP<0.01 vs TNBS组;

^fP<0.01 vs TNBS+NS组.

2.4 血清中IL-12的浓度及血清IL-12/IL-4比值

三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组较空白对照组中血清中IL-12浓度及IL-12/IL-4比值增高(P<0.01, 表4)而三硝基苯磺酸+达纳康组较三硝基苯磺酸组与三硝基苯磺酸+生理盐水组血清中IL-12浓度及IL-12/IL-4比值明显下降(P<0.01, 表4). 三硝基苯磺酸组与三硝基苯磺酸+生理盐水组血清中IL-12浓度及IL-12/IL-4比值无明显改变.

表4 大鼠血清白介素-12浓度(mean±SD)及IL-12/IL-4比值(mean±SD).

分组	血清IL-12	IL-12/IL-4
Normal	4.6±0.8	0.6±0.1
TNBS	25.8±4.8b	6.4±1.8b
TNBS+NS	22.9±4.1b	3.97±0.77b
TNBS+EGb	8.2±2.2df	1.13±0.49df

^bP<0.01 vs Normal;

^dP<0.01 vs TNBS组;

^fP<0.01 vs TNBS+NS组.

2.5 IFN-α/IL-4比值

三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组较空白对照组, 脾细胞, 血清和大肠黏膜中较空白对照组脾细胞, 血清和大肠黏膜中IFN-α/IL-4比值明显升高(P<0.01, 表5). 而三硝基苯磺酸+达纳康组较三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组中脾细胞, 血清和大肠黏膜中IFN-α/IL-4比值明显下降(P<0.01, 表5). 三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组无明显改变.

表5 IFN-α/IL-4比值(mean±SD).

	脾淋巴细胞	大肠黏膜	血清
Normal	5.6±0.8	15.6±3.9	0.76±0.2
TNBS	21.9±4.9b	65.9±18b	3.4±0.8b
TNBS+NS	16.6±4.9b	49.2±10.6b	1.9±0.4b
TNBS+EGb	5.5±2.0df	20.9±7.97df	1.1±0.3df

^bP<0.01 vs Normal;

^dP<0.01 vs TNBS组;

^fP<0.01 vs TNBS+NS组.

3 讨论

达纳康(EGb)具有很强的抗氧自由基, 增强抗氧酶, 活性的作用. 对心、脑、肾、血管缺血性损伤有明显的防护作用. 可增强中枢神经系统功能. 可拮抗血小板活性因子(PAF)(platelet activating factor)达到保肝效果[20-23]. 但有关EGb对炎症性肠病疗效的报道较少.

炎症性肠病的病因和发病机制尚不明确. 随着分子生物学技术以及基础研究的不断进展, 对于T细胞各种细胞因子的作用, 特别是促炎因子与抗炎细胞因子的研究大大推动了IBD的发病机制的研究和机应治疗的进展[24-25]. Th1/Th2的细胞因子水平已为解释一些自身免疫性疾病提供了很好的模型. 辅助性T细胞根据CD4+细胞分泌的两类不同细胞因子, 分为Th1和Th2细胞, Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-α、IFN-β等, 而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等, Th1/Th2细胞具有相互拮抗作用, 通过阻止另一类细胞的产生成效应功能的实现来影响Th1/Th2细胞间的平衡, IL-12可通过NK细胞诱导IFN-α的复制, 可刺激原初CD₄⁺T细胞分化为Th1亚群, 相应的IL-12和IFN-α的产生可控制Th1及Th2优势的T细胞的发展. 这样有助于Th1分化优势及对IL-4和IL-10的控制并提高Th2的分化. IFN-α能促进Th2细胞分化为Th1细胞, 影响Th1/Th2比率, 而IL-4能促进Th0细胞分化为Th1细胞, 并抑制Th1细胞, 分沁其系列因子, 促进体液免疫应答. Th1细胞主要介导与细胞和局部炎症有关的免疫应答, 参与细胞免疫而Th2细胞的主要功能为刺激及细胞增生并产生抗体与体液免疫有关. 机体要处于良好的免疫状态, 应保持Th1/Th平衡, 才能使机体不处于免疫抑制状态. 研究表明Th1/Th2细胞因子在IBD的发病中有重要的作用, 如何调理Th细胞的分化, 对临床疾病的治疗有重大意义[26-32].

炎症性肠病(IBD)是一类主要累及结、直肠的自身免疫性疾病, TNBS诱导的大鼠结肠炎组织学改变的许多特点与人类IBD相似, TNBS诱发结肠炎的确切机制尚未阐明, 可能为TNBS与结肠炎上皮细胞的赖氨酸共价结合, 从而改变表面蛋白质, 形成自身抗原, 导致一系列免疫反应所致. TNBS诱导的结肠炎以IL-12驱动的Th1反应为主. 以IFN-α升高为标志[33-34]. 抗IL-12治疗可改善其炎症[35]. 表现为全结肠全层性炎症和溃疡偶见肉芽肿, 炎症持续时间长, 便于观察药物疗效等. TNBS模型广泛用于筛选有治疗IBD潜力的疗法及研究其作用机制. 该模型持续时间较长, 体现急性炎症向慢性转化的动态过程并伴以溃疡形成, 该模型TNBS价格有限, 实验花费不大, 简单易行, 易于复制, 是一种较为理想的结肠炎动物模型. 故本实验采用三硝基苯磺酸灌肠建立大鼠溃疡性结肠炎模型, 探讨达纳康对溃疡性结肠炎的保护作用.

我们应用达纳康治疗部分溃疡性结肠炎, 取得较好的临床疗效. 本实验通过在建立大鼠UC模型的用达纳康灌胃治疗后, 结果TNBS+EGb组大鼠肠黏膜组织大体形态和组织学评分明显低于单纯TNBS组和TNBS+NS组. 本研究结果表明, TNBS诱导的实验性大鼠结肠炎模型的血清病变局部的大肠黏膜, 以及脾细胞产生的IFN-α升高, IL-12升高, 提示Th1细胞功能加强, 而IL-4降低, 提示Th2细胞功能下降, IFN-α/IL-4比值升高, IL-12/IL-4比值升高, 机体Th1/Th2细胞平衡紊乱, 提示TNBS诱导的实验性大鼠肠炎模型, 是以Th1亚型为主的免疫应答反应[36]. Th1/Th2平衡遭受破坏是UC的发病机制之一.

本研究表明达纳康既可抑制IL-12、IFN-α(Th1)生成, 又可提高IL-4生成, 由此可以推测, 达纳康治疗UC的机制可能与其抑制IL-12, IFN-α(Th1)生成, 恢复Th1/Th2的细胞因子的平衡有关. 达纳康作为抗UC的药物具有良好的临床应用前景.

备注

编辑: N/A

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