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世界华人消化杂志. 2004-02-15; 12(2): 344-346
在线出版日期: 2004-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i2.344
癌基因对大鼠肝卵圆细胞分化和转化的影响
廖冰, 薛玲, 何萍, 赵国强, 车丽洪
廖冰, 薛玲, 何萍, 赵国强, 车丽洪, 广州中山大学中山医学院病理学教研室 广东省广州市 510080
廖冰, 女, 1975-09-16生, 广东省湛江市人, 汉族. 1998年广州中山医科大学学士, 2003年广州中山大学医学硕士, 在读医学博士生, 助教. 主要从事肝癌及消化系统肿瘤研究.
基金项目: 国家教委回国人员启动基金资助项目, No. 2000479; 国家自然科学基金资助项目, No. 30170473.
通讯作者: 薛玲, 510080, 广东省广州市中山二路74号, 中山大学中山医学院病理教研室. lxue99@pub. guangzhou.gd.cn
电话: 020-87330525 传真: 020-87331679
收稿日期: 2003-06-26
修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-09-18
在线出版日期: 2004-02-15

目的: 通过对体外培养的大鼠卵圆细胞进行AFP和c-ras、c-myc基因的动态测定, 观察二者在卵圆细胞转化过程中的变化特点, 探讨癌基因对细胞分化和转化的影响.

方法: 用化学致癌剂3'-Me-DAB诱发出SD大鼠肝卵圆细胞增生, 采用Percoll密度梯度离心法分离之, 并进行长期体外培养. 在培养过程中, 通过免疫荧光流式细胞仪和RNA-DNA slot blot杂交分别测定细胞AFP及癌基因的表达情况.

结果: AFP及c-ras、c-myc在卵圆细胞体外培养的不同时期呈现同步升高或降低: 培养初期, 卵圆细胞AFP及癌基因均呈高表达, 而后下降; 第20代时再次升高, 之后维持在较低的表达水平. 至第65代时, 卵圆细胞不仅呈现出生长速度加快、群体倍增时间缩短、多倍体核型及软琼脂生长, 而且癌基因及AFP的表达亦第3次升高.

结论: 癌基因及其产物不仅参与细胞的转化过程, 亦可调节细胞的分化.

关键词: N/A
引文著录: 廖冰, 薛玲, 何萍, 赵国强, 车丽洪. 癌基因对大鼠肝卵圆细胞分化和转化的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 344-346
Effect of oncogenes on differentiation and transformation of rat oval cells
Bing Liao, Ling Xue, Ping He, Guo-Qiang Zhao, Li-Hong Che
Bing Liao, Ling Xue, Ping He, Guo-Qiang Zhao, Li-Hong Che, Department of Pathology, Zhongshan Medical College, Zhongshan University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by: the Foundation of National Education Committee, No. 2000479 and National Natural Science Foundation of China, No. 30170473.
Correspondence to: Dr. Ling Xue, Department of Pathology, Zhongshan Medical College, 74 Zhongshan 2th Road, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China. lxue99@pub.guangzhou.gd.cn
Received: June 26, 2003
Revised: August 10, 2003
Accepted: September 18, 2003
Published online: February 15, 2004

AIM: To study the effects of oncogenes on differentiation and transformation of oval cells by detecting and characterizing the expression of AFP and Ha-ras, c-myc genes of rat oval cells in vitro.

METHODS: Proliferation of rat oval cells was induced by chemical carcinogen, 3'-Me-DAB. By using Percoll density gradient centrifugation method, oval cells were isolated,followed by continous cultivation in vitro. The expression of Ha-ras and c-mycgenes and AFP in the oval cells from cultures was dynamically observed by RNA-DNA slot blot hybridization and flow cytometry.

RESULTS: The expression of AFP and Ha-ras, c-myc genes in the cultured oval cells from different phases was synchronous: At the beginning of oval cell cultivation in vitro, both of AFP and oncogenes displayed a higher level expression and then declined. Up to 20th passage, the expression of AFP and oncogenes went up again and then kept a lower level. To 65th passage, the oval cells not only presented a growth rate increased, population doubling time shortened, adiploid chromosomes and growing on soft agar, but also the expression of oncogenes and AFP went up again.

CONCLUSION: Oncogenes and their products participate not only in the regulation of cellular transformation, but also in the process of cell differentiation.

Key Words: N/A
0 引言

细胞的体外转化与体内肿瘤的形成一样, 涉及到多种原癌基因的激活、抑癌基因的失活及一系列复杂的调控机制失常[1-18]. 实验证实, myc和ras基因属两类不同的原癌基因, 二者在细胞的转化过程中起协同作用, 共同维持细胞的恶性转化表型. 卵圆细胞是肝内的干细胞, 在原发性肝癌的发生中可能具重要作用. 通过对卵圆细胞在体外培养过程中癌基因及AFP的表达变化的观察, 对于探讨癌基因对细胞转化和分化过程的作用及影响具有重要意义.

1 材料和方法
1.1 材料

我校动物中心提供二级标准SD大鼠, 体质量100-120 g, 稳定饲养1 wk后, 改喂含0.6 g/L 致癌剂3'-Me-DAB(东京化成工业株式会社)的饲料. 4 wk后, 取动物肝脏, 用Percoll密度梯度离心法分离出卵圆细胞, 并接种于塑料培养瓶, 加入含20%小牛血清及各种氨基酸的培养液, 置37 ℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养. 自15代开始, 在培养液中加入20 mg/L EGF继续培养.

1.2 方法

将10万细胞接种于直径6 cm的塑料培养皿中, 第2 d计数活细胞数作为基数, 以后连续7 d, 每天数3个平皿, 取其平均数, 计算倍增时间并绘制生长曲线. 从第10代起, 每隔5-10代进行1次测定. 卵圆细胞培养转化过程中染色体制作参照鄂征主编的《组织培养技术》 一书中介绍的方法进行. 油镜下至少数50个完整的分散好的中期分裂相细胞, 计数其染色体数目. 制备双层琼脂, 其中上层琼脂含10万个细胞, 凝固后置于37℃ CO2孵箱中培养4 wk后观察结果. 从培养的第35代起, 每10代进行1次Balb/c裸小鼠接种成瘤试验. 接种细胞数为5×106, 接种部位为腋窝下, 4 wk后观察有无成瘤.

1.2.1 卵圆细胞rasP21、AFP免疫荧光FCM测定: 收集不同培养时期的卵圆细胞, 700 mL/L酒精固定, 离心后PBS洗2次, 不锈钢网过滤除去细胞团块. 调整细胞数至5×109/L. 取样本100 μL, 分别加入一抗rasP21(Dako公司)和AFP(Dako公司), 室温孵育30 min. 加入荧光标记抗体, 室温30 min. 加PBS 1 mL, 吹打细胞至均匀的单细胞相, 即行测定. 阴性对照管不加一抗. 所用流式细胞仪(epics elite)检测的激发波长488 nm, 发射波长525 nm. 检测细胞数为5 000-10 000个. 上样测定前用人红细胞对仪器进行调整校对. 所有标本一次测完, 使其处于同一测定条件下.

1.2.2 卵圆细胞总RNA的提取及RNA-DNA Slot blot杂交: 常规提取不同培养时期卵圆细胞的总RNA, 用狭缝点样器将变性之RNA点于尼龙膜(宝灵曼)后进行杂交. 所用癌基因探针质粒(c-Ha-ras PBR322, 6.6 kb, Bam H I, Ki-ras PBR322 1.0 kb EcoRⅠ, c-myc PBR322 8.5 kb HindⅢ/EcoRⅠ)由北京中国医学科学院肿瘤研究所提供, DIG标记(标记试剂盒为德国宝灵曼公司产品 ), 标记方法为随机引物法. 常规洗膜. 将尼龙膜封入杂交袋内, 加入CSPD(宝灵曼), 5 min后倾出CSPD液, 将膜压入X光暗盒曝光于X光胶片, 常规显影、定影. 胶片用Kontron IBASS 2.0图像分析处理仪(German)扫描分析结果.

2 结果

卵圆细胞的生长速度随着体外培养时间的增长而加快, 传代时间从最初的10-14 d一代缩短至2-3 d一代, 且细胞由单层生长变为重叠生长. 细胞的群体倍增时间随着培养代数的增高而缩短, 第10代时为40.9 h, 第35代时为18.9 h, 至第65代时减至15.65 h, 呈明显的递减趋势. 卵圆细胞体外培养过程中染色体数目在第10代时, 基本为整倍体; 第35代时染色体数目为29-61, 异倍体细胞率为80%; 第65代时, 则染色体数目范围为23-81, 异倍体细胞率达82%. 卵圆细胞在体外培养至第35代, 将细胞接种于软琼脂中, 4 wk后在倒置显微镜下可见少数克隆生长, 3个平皿分别可见2, 5, 7个克隆, 平均克隆数为4.7个, 且克隆较小, 其直径为0.1 mm. 当卵圆细胞培养至65代时, 软琼脂克隆形成数目大大增多, 3个平皿分别见7 865, 5 875和6 960个克隆生长, 平均克隆数为6 900个, 且克隆体积较第35代时明显大, 直径大于0.1 mm, 表明细胞生长异常活跃. 从卵圆细胞体外培养至第35代起, 每10代进行一次裸鼠皮下接种细胞成瘤实验, 但至第65代仍未能成瘤.

2.1 rasP21, AFP的表达

卵圆细胞体外培养转化过程中, 正常肝细胞rasP21及AFP荧光强度值FCM测定与阴性对照无明显差别, 故我们视之为rasP21及AFP表达阴性. 卵圆细胞培养的初期, rasP21与AFP均有较高水平的表达, 而后下降; 当第 15代加入EGF后, 第20代细胞再次出现rasP21和AFP的表达升高; 以后虽然各代细胞均有rasP21、AFP的表达, 但水平较低, 至第65代时又再次升高(表1).

表1 卵圆细胞rasP21, AFP免疫荧光值及c-myc、Ha-ras、Ki-ras mRNA的表达.
细胞代数荧光强度(mean±SD )
平均灰度
rasP21AFPc-mycHa-rasKi-ras
P102.87±1.581.95±1.0112.229.936.64
P151.86±1.300.63±0.308.34.82
P202.82±2.161.75±1.2411.658.6
P251.98±0.590.96±0.433.225.96
P351.86±1.310.86±0.549.826.24
P451.76±1.850.51±0.2611.4511.795.81
P551.77±1.800.55±0.388.675.56
P652.66±1.641.36±0.9213.217.53.34
2.2 c-myc、Ha-ras、Ki-ras mRNA的表达

卵圆细胞在体外培养转化过程中, c-myc, Ha-ras和Ki-ras三种癌基因的表达不是呈持续性升高或持续性降低, 而是表现为升高、降低交替出现. 在细胞生长的早期阶段, 三种癌基因均保持在一定的高表达水平, 而后下降. 第35代(开始出现软琼脂生长)时c-myc和Ha-ras再次升高, 但Ki-ras未能检测到. 至第45代, c-myc, Ha-ras和Ki-ras均升高, 直至第65代(表1). 总体来说, 三种癌基因的表达基本保持同步升高或降低.

3 讨论

癌基因与细胞的生长、发育、分化及癌变密切相关[1-18]. 在致癌因素的作用下, 原癌基因被激活并高度表达, 产生大量转化蛋白, 使正常细胞的增生和分化机制发生紊乱, 导致细胞无控制地增生, 从而引起细胞癌变. 已知myc和ras基因属两类不同的原癌基因, 前者的产物为一种转化蛋白, 位于细胞核内, 在细胞增生过程中起重要作用, 可使原代培养细胞获得永生性而具有无限制生长的能力, 同时参与细胞分化的调节; 后者的产物位于细胞质膜内面, 具有与G蛋白相似的功能, 并有GTase活性, 其作用是使细胞处于激发状态, 并使细胞表型发生变化. c-myc与c-ras基因在细胞的转化过程中起协同作用, 共同维持细胞的恶性转化表型[19-20]. 过去认为原癌基因仅同细胞分裂、生长及转化有关, 现已有证据表明, 原癌基因至少在人体和动物的某些组织、个体发育的某个特定阶段参与调节细胞的分化, 因为在胚胎组织中可检测到不少原癌基因的明显表达.

本实验中, rasP21有三次升高, 且均与ras mRNA的表达升高保持同步, 提示rasP21的增高可能是ras基因基因放大或过表达所引起. 同时我们推测, 第一次升高的P21蛋白与后两次升高的P21蛋白可能是不同性质的ras基因产物: 设想当致癌剂作用于肝脏后, 引起ras基因扩增并过表达, 产生较多的野生型P21蛋白参与卵圆细胞的增生与分化调节. 已知GF具有某些癌基因产物的作用, 可通过调节其他癌基因的表达和影响细胞的信号传导而促进细胞生长, 加速细胞转化[20-23]. 卵圆细胞培养至15代后, 由于EGF的介入(可能还有其他因素的参与), 不仅引起c-myc和Ha-ras再次过表达, 同时亦可能引起了基因的突变(点突变、基因重排等), 由此导致其表达产物P21蛋白不仅在量上发生了变化, 而且在质上亦发生了改变(即编码产生突变型P21蛋白). 这种改变导致了细胞朝着恶性转化方向发展, 不仅使细胞有了恶性表型(包括生长加快、形态变化、核型改变等), 同时在c-myc的协同作用下获得了永生性并不断增生, 最终发生转化.

AFP是肝细胞癌重要的标志物之一. 由于他在人的胚胎时期有高表达(由胚胎肝细胞和卵黄囊产生), 而出生后则迅速降低, 故而AFP既可作为幼稚肝细胞和肝癌细胞的标志物, 亦可作为卵圆细胞具有肝细胞某些表型特点的佐证. 从我们的实验结果可见, 卵圆细胞在体外培养、转化过程中, AFP与Ha-ras和c-myc mRNA的表达一样, 反复出现了三次升高. 结合相应时期细胞的形态、生长速度、核型变化及软琼脂生长与否, 我们认为, 第1次 AFP的升高(第10代)主要为未分化幼稚的卵圆细胞所产生, 他表明卵圆细胞具有肝细胞的某些表型特征. AFP的再次升高(第15代)可视为在癌基因及其产物的作用下, 卵圆细胞逐步增生、转化成为具有某些恶性性质的群体(至少有部分细胞如此). 而AFP的第3次升高(第65代), 此时卵圆细胞无论在核型、倍增时间、或是软琼脂生长方面都表现出恶性细胞的特点, 而AFP的升高则进一步提示卵圆细胞此时可能转化为具有一定恶性表型、可表达AFP的肝肿瘤细胞.

综观卵圆细胞体外培养转化过程中c-myc、Ha-ras、Ki-ras mRNA、rasP21及AFP的表达变化, 提示细胞的体外转化有赖于两种或两种以上癌基因的协同作用; 癌基因及其产物不仅参与细胞的转化过程, 亦可调节细胞的分化.

编辑: N/A

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