病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2004. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2004-02-15; 12(2): 315-318
在线出版日期: 2004-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i2.315
HCV包膜糖蛋白E2基因的克隆、蛋白表达及纯化
杜德伟, 贾战生, 秦鸿雁, 刘秋平, 周永兴, 韩骅
杜德伟, 贾战生, 刘秋平, 周永兴, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
秦鸿雁, 韩骅, 中国人民解放军第四军医大学基础部医学遗传学与发育生物学教研室 陕西省西安市 710032
杜德伟, 男, 1966-08-30生, 吉林德惠市人, 汉族. 1989年第四军医大学本科毕业, 2001年第四军医大学硕士研究生毕业, 医学博士研究生, 主治医师, 讲师, 主要从事病毒性肝炎致病机制及基因治疗研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助课题, No. 30070687.
通讯作者: 贾战生, 710038, 陕西省西安市灞桥区新医路1号, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心. jiazsh@fmmu.edu.cn
电话: 029-3377742
收稿日期: 2003-10-15
修回日期: 2003-10-25
接受日期: 2003-11-19
在线出版日期: 2004-02-15

目的: 获得大量重组HCVE2蛋白, 为研究E2蛋白的功能及制备其抗体奠定基础.

方法: 利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出 831 bp(384-661 aa)的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a(+)上, 得到重组质粒pET32a-HCVE2, 转化大肠杆菌BL-21 (DE3)菌株, IPTG诱导HCV E2蛋白表达, SDS-PAGE 和Western blot检测蛋白表达, Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化融合蛋白.

结果: 经IPTG诱导后, 可见分子量约55 000的融合蛋白表达; 表达的蛋白主要以包涵体形式存在; 经Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化的融合蛋白与抗His抗体及HCV阳性血清具有良好的反应原性.

结论: HCV E2基因的克隆、表达及其融合蛋白的纯化为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.

关键词: N/A
引文著录: 杜德伟, 贾战生, 秦鸿雁, 刘秋平, 周永兴, 韩骅. HCV包膜糖蛋白E2基因的克隆、蛋白表达及纯化. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 315-318
Cloning of HCV E2 gene and expression and purification of HCV envelope glycoprotein E2
De-Wei Du, Zhan-Sheng Jia, Hong-Yan Qin, Qiu-Ping Liu, Yong-Xing Zhou, Hua Han
De-Wei Du, Zhan-Sheng Jia, Qiu-Ping Liu, Yong-Xing Zhou, Chinese PLA Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Hong-Yan Qin, Hua Han, Department of Medical Genetics and Developmental Biology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by: the National Natural Science foundation of China, No. 30070687.
Correspondence to: Zhan-Sheng Jia, Department of Medical Genetics and Developmental Biology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China. jiazsh@fmmu.edu.cn
Received: October 15, 2003
Revised: October 25, 2003
Accepted: November 19, 2003
Published online: February 15, 2004

AIM: To obtain large amount of HCV E2 protein, and to understand the function of the protein and to prepare the antibody against this protein.

METHODS: A 831bp of E2 gene fragment was amplified by PCR method from HCV genome and cloned into pET32a(+) vector, an E. coli expression vector, to construct a recombinant plasmid pET32a-HCVE2.The plasmid was transformed into E. coli BL-21 (DE3) to express E2 protein with IPTG induced. The protein E2 fused with HIS tag was purification by Ni-NTA resin column. The protein E2 fused with His tag was detected by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot.

RESULTS: A novel protein with molecular weight of Mr 55 000 was expressed upon induction with IPTG in E. coli. The expressed product showed good reactivity to anti-His tag antibody and the HCV positive serum.

CONCLUSION: Cloning of HCV E2 gene and the expression and purification of envelope glycoprotein E2 lay a foundation of further study on HCV E2 protein and the receptors of hepatitis virus C.

Key Words: N/A
0 引言

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的世界性传染病[1-13]. 全世界约有1.7亿HCV感染者, 是HIV-1感染者的5倍[13]. HCV感染后约70%转化为慢性, 并与肝硬化、肝衰竭和肝癌的发生密切相关. HCV感染已经成为威胁人类健康的重要因素之一. 长期以来, 由于缺乏稳定的HCV体外感染的细胞模型和小动物模型, 限制了对HCV发病机制的研究, 迄今为止, 对于HCV的肝细胞嗜性尚无合理解释, 肝细胞表面参与HCV识别、黏附、及入胞的分子还不完全清楚. 研究表明, E2糖蛋白是介导HCV与细胞表面CD81[14-18], B族I型清道夫受体(SR-BI)[19]和DC-SING/DL-SIGN[20-22]等候选受体结合的配体. 本文利用基因工程技术克隆了HCV E2基因, 并利用pET原核表达系统进行表达, 通过Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化了HCV包膜糖蛋白E2, 为进一步开展该蛋白的功能和HCV受体的研究奠定了基础.

1 材料和方法
1.1 材料

T载体PMD18-T系 Takara公司产品. pET32a(+)为Novagen产品. 含有HCV H77株全基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011由美国华盛顿大学的Rice CM惠赠, HCV阳性血清为本室保存. 大肠杆菌BL-21(DE3)、XL-10-gold菌株均由第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室提供. 限制性内切酶、DNA 连接溶液Solution I、CIAP、标准分子量DNA、标准分子量蛋白质、PCR试剂盒、IPTG等购自Takara公司. 质粒纯化、DNA回收试剂盒购自华舜公司. 用于蛋白纯化的Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱、Western blot检测使用的Hybond ECL硝酸纤维膜均为Pharmacia公司产品. ECL发光试剂购自Pierce公司.

1.2 方法

1.2.1 HCV包膜蛋白E2基因的扩增及序列测定: 根据Genbank中HCV H株基因序列, 设计出针对HCV E2基因序列的引物, 上游引物序列为: 5'-GGA TCC GAA ACC CAC GTC ACC- 3', 下游引物: 5'-GAG CTC GGA CCT GTC CCT GTC- 3', 其中上、下游引物的5'端分别引入BamH I和Sac I酶切位点. 应用PCR试剂盒扩增目的基因, 总反应体积为50 μL, 循环参数为: 95℃ 4 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环, 再于72℃延伸7 min. 将PCR扩增产物克隆入载体pMD18-T中, 构建pMD18-T-HCVE2, 酶切鉴定正确后, 交由上海生工公司进行DNA序列测定.

1.2.2 HCV包膜糖蛋白原核表达载体的构建: 以BamH I和Sac I双酶切测序正确的PMD18-T-HCVE2, 获取HCVE2基因. 以BamH I和Sac I双酶切pET32a(+)载体, 分别回收HCVE2基因和pET32a(+)载体片段, Solution I连接上述基因和载体片段, 构建HCV包膜糖蛋白E2原核表达载体pET32-HCVE2, 转化E. coli XL-10感受态细胞, 用含Amp的LB平板筛选阳性克隆, 小量提取质粒并酶切鉴定.

1.2.3 HCV包膜糖蛋白的原核表达、纯化及检测: 以HCV包膜糖蛋白E2原核表达载体pET32 a-HCVE2转化E. coli BL-21(DE3)感受态细胞, 挑取用含Amp的LB平板筛选的阳性克隆于LB培养基中, 37℃振摇过夜, 按1: 100转接到LB培养基中, 37℃振摇约4 h, 使A600约0.6 (0.4-1), 加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG继续培养诱导3 h, 于4℃离心10 000 r/min×1, 收集菌体并裂解, 4℃离心10 000 r/min×10, 分别取上清及沉淀(包涵体), 进行SDS-PAGE电泳进行可溶性分析. 同等条件下进行大量诱导, 收集并用8 mol/L (pH 8.0)尿素溶解包涵体后, Ni-NTA偶联的琼脂糖珠黏附融合蛋白, 用pH值分别为6.3, 5.9及4.5的8 mol/L尿素液体洗脱蛋白, 不同浓度的尿素梯度透析复性, Western blot检测蛋白抗原性.

2 结果
2.1 HCV包膜蛋白E2基因的扩增、克隆及序列测定

HCV包膜蛋白E2基因的PCR产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见约840 bp特异性条带(图1), 回收片段后插入pMD18-T, 形成pMD18-T-HCVE2, 酶切鉴定得到正确克隆, 以M13+/M13-为引物进行序列测定. 测序结果与Genbank中HCV 77株基因序列比对无突变.

图1
图1 HCVE2 基因的克隆. M: DL2000 DNA Marker 1-4: HCVE2 基因的PCR产物 (小片段为引物二聚体).
2.2 HCV包膜蛋白E2原核表达载体pET32a-HCVE2构建

用BamH I和Sac I双酶切pMD18-T-HCVE2, 回收片段后与经过相同酶切的pET32a(+)连接, 转化E. coli XL-10-gold感受态细胞, 用含Amp的LB平板筛选阳性克隆, 挑单克隆扩增小量提取质粒并酶切鉴定. Bam H I和Sac I双酶切得到约840 bp和4 500 bp的片段, 与预期的大小一致(图2).

图2
图2 质粒pET32a-HCVE2酶切鉴定. M1、M2: 标准DNA Marker; 1-3: pET32a-HCVE2经BamH I和Sac I 双酶切鉴定.
2.3 pET32a-HCVE2的原核表达及鉴定

将原核表达载体pET32a-HCVE2转化到 E. coli BL-21 (DE3)感受态细胞中, 经IPTG诱导后, 可见Mr 55 000的融合蛋白(图3A), 可溶性分析显示融合蛋白主要以包涵体形式表达, 用pH值为8.0的8 mol/L尿素溶液溶解包涵体, Ni-NTA偶联的琼脂糖珠亲和纯化融合蛋白, 用pH值为4.5的8mol/L尿素溶液洗脱融合蛋白(图3B), 用薄层扫描分析融合蛋白的纯度达到95.6%. 转化pET32a(+)空载体的BL-21菌仅表达Mr 20 400的Trx-His标签蛋白, 分别以anti-His及HCV阳性血清为一抗做Western blot, 均可检测到表达的融合蛋白(图4, 5).

图3
图3 A: 不同诱导时间融合蛋白表达的SDS-PAGE分析. M: 低分子质量蛋白质; 1: 未诱导的 pET32a(+)空载体; 2: 诱导的pET32a(+)空载体; 3: 未诱导的pET32a-HCVE2; 4: 4-8: pET32a-HCVE2经0.5 mmol/L IPTG诱导1-5 h 融合蛋白的表达; B: HCVE2-His融合蛋白纯化. 1: BL-21(DE3)全菌中的融合蛋白; 2: Ni-柱纯化的融合蛋白.
图4
图4 抗-His抗体Western blot检测HCVE2-His融合蛋白的表达. 1: 转化空载体pET32a的BL-21细菌; 2: 转化pET32a-HCVE2的BL-21细菌裂解上清; 3: 转化pET32a-HCVE2的BL-21细菌包涵体.
图5
图5 HCV 阳性血清Western blot检测HCVE2-His融合蛋白的表达. 1: 转化空载体pET32a的BL-21细菌; 2: 转化pET32a-HCVE2的BL-21细菌裂解上清; 3: 转化pET32a-HCVE2的BL-21细菌包涵体.
3 讨论

HCV为正链RNA包膜病毒, 与庚型肝炎病毒、黄热病毒及登革热病毒同属黄病毒属, HCV基因组含有一个大的读码框, 编码一个约含有3 000个氨基酸的前体蛋白, 经过翻译及翻译后加工, 形成结构蛋白和非结构蛋白[23-25]. 其中结构蛋白E1, E2形成复合物构成HCV的包膜蛋白[26-27]. 肝细胞为其天然靶细胞, 同时B淋巴细胞、单核巨噬细胞及树突状细胞也是HCV的易感细胞[28]. 在病毒感染细胞的过程中包膜糖蛋白与细胞表面膜受体结合, 介导病毒入胞是病毒感染制病的关键. HCV感染的持续性表明宿主对病毒缺乏有效的免疫应答. HCV的E2区基因N末端高变区HVR1含有三个B细胞表位: 400-409 aa, 398-410aa以及399-405 aa, 这个区域内基因的变化, 可能允许病毒逃避免疫监视; 对E2区多肽产生的细胞免疫应答, 可能对抵抗HCV攻击和清除HCV感染起重要的作用[29]. 另外, E2(614-622) 是HLA-A2+慢性感染者的CTL表位, 此区的可变性位于aa622, 锚定在HLA-A2分子上, 改变该氨基酸残基可影响肽段与HLA的结合和CTL识别, 此肽段对CTL的识别作用高度保守. 通过对这一表位的修饰可以达到提高HCV细胞免疫的作用[30].

由于机体清除体内感染的病毒常与针对病毒包膜糖蛋白产生的抗体有关, 因此, 对HCV包膜糖蛋白E2的研究具有重要的意义. Shi et al[31]用原核表达的HCV包膜糖蛋白E2检测HCV感染者, 其血清抗E2抗体的阳性率达60%以上, 且部分E2抗体阳性血清抗HCV核心抗体阴性. 慢性HCV感染者有很高的HCV包膜糖蛋白E2抗体阳性率, 且能够很好地反应HCV mRNA 的存在, 因此, 许多学者认为抗HCV包膜糖蛋白E2抗体是HCV感染检测的新指标. 了解HCV靶向肝细胞及肝外组织的分子基础对于揭示丙型肝炎的发病机制至关重要. 尽管在HCV蛋白及其基因复制方面已经取得了很大的进步. 但是, 缺乏可靠的病毒培养扩增体系统成为研究HCV组装及入胞的主要障碍. 利用昆虫细胞组装HCV病毒样颗粒(VLP)可作为HCV的替代品, 以帮助研究HCV的入胞过程[32-34]. 但是, VLP不具有感染细胞的能力, 无法用于HCV受体的功能研究. 我们成功地克隆了HCV包膜糖蛋白E2的基因并构建了其原核表达载体, 转化BL-21(DEC)后, 经IPTG诱导后获得高效表达, NI-NTA黏附柱纯化获得了与His标签融合的E2包膜糖蛋白, 分别以anti-His及HCV阳性血清为一抗做Western blot检测证实该融合蛋白具有一定的生物学活性. 用此融合蛋白免疫新西兰兔后, 获得了高效价的抗血清(未发表). 如将E2抗原加入目前的HCV检测试剂中, 有可能改善现有HCV检测试剂的特异性和敏感性[35]. 而抗血清的获得为研究HCV包膜糖蛋白E2的生物学特性及其功能提供了有效工具.

由于包膜糖蛋白E2是糖蛋白, 糖基化对其抗原性影响很大[27,36-37], 而真核表达系统才具有糖基化功能, 本研究已经获得编码正确的HCV E2基因, 对于真核表达载体的构建及今后HCV的疫苗研究都具有重要价值. 同时为进一步组装具有感染能力的假病毒[38]奠定了基础.

编辑: N/A

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