修回日期: 2003-07-25
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性病毒性肝炎的主要肝炎病毒类型, 而且也是肝细胞癌(HCC)的重要病因. HBV和HCV感染肝细胞之后, 表达出肝炎病毒蛋白, HBV和HCV蛋白通过与转录因子蛋白结合, 或通过对于肝细胞内信号转导通路的影响, 使肝细胞基因组的转录表达产生异常的调节, 从而影响HCC的发生.
引文著录: 成军. 肝炎病毒蛋白对肝细胞基因组转录调节及信号转导机制的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 253-257
Revised: July 25, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(2): 253-257
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i2/253.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i2.253
HBV和HCV是引起慢性病毒性肝炎的主要肝炎病毒类型, 而且也是肝细胞癌(HCC)的重要病因[1-2]. 虽然临床研究资料和流行病学研究资料都显示HBV、HCV感染参与HCC的形成有关, 但是, 多年来对于这2种肝炎病毒参与HCC发生、发展的机制一直不十分清楚[3-4]. 近年来人类基因组计划(HGP)和功能基因组学(functional genomics)研究为阐明肝炎病毒与HCC之间的关系, 提供了大量的信息和技术平台, 使得关于肝炎病毒与HCC发生之间的关系和机制研究, 进入了一个崭新的阶段[5-6]. 研究表明, HBV和HCV蛋白对于肝细胞基因组转录调节机制的影响占有十分重要的地位. HBV和HCV感染肝细胞之后, 表达出肝炎病毒蛋白, 这种正常的肝细胞中不存在的蛋白类型, 通过直接或间接的途径, 与转录因子蛋白结合, 或通过对于肝细胞内信号转导通路的影响, 对于肝细胞基因组的转录表达产生异常的调节, 抑癌基因(tumor suppression gene)的表达水平下降或失活, 以及原癌基因(proto-oncogene)和癌基因(oncogene)的激活、过表达, 都对HCC的发生发展产生影响[7-10].
HBV表面抗原大蛋白(LHBs)以及C-末端截短型的表面抗原中蛋白(MHBst)组成了HBV前-S2 反式激活蛋白家族. 这一蛋白家族成员的反式激活作用主要取决于前-S2结构域在细胞质中的定向[11-12]. Hildt et al[13]研究发现MHBst是蛋白激酶C(PKC)催化的Ser28位点磷酸化修饰依赖性的. 这一磷酸化位点的存在是这一反式激活作用蛋白家族所必须具备的结构条件. MHBst可以触发PKC依赖性的c-Raf-1/Erk2信号转导途径的激活, 这也是MHBst激活转录因子AP-1、NF-kB的先决条件. 为了研究MHBst体内反式激活作用的病理生理学意义, 建立了表达MHBst的转基因小鼠模型, 在这一模型的肝脏中观察到了前-S2依赖性的c-Raf-1/Erk2持续激活, 造成肝脏细胞的增生能力提高. 在15月龄的小鼠中肝脏肿瘤的发生率显著升高. 这些研究资料表明前-S2反式激活剂LHBs、MHBst具有促进肿瘤形成的作用, 主要机制是通过激活肝细胞增生相关的蛋白酶类.
大规模的流行病学调查研究结果表明, HBV携带者较非携带者发生HCC的危险度提高了10倍. 几乎所有的 HBV相关的HCC肿瘤细胞基因组中都有HBV DNA的整合. 整合在肝细胞基因组中的HBV DNA可能编码2种不同反式激活病毒蛋白HBxAg和前-S2反式激活蛋白. 根据肿瘤发生的2步学说, 前-S2反式激活蛋白的作用具有促癌作用蛋白的性质, 主要是通过PKC/c-Raf-1/MAP2激酶信号转导系统[14-16].
C-末端截短167 个氨基酸残基MHBst(MHBst167)对于HBV基因组的复制和表达也具有重要的调节作用. 在Chang或HepG2 细胞的瞬时转染实验研究中发现, MHBst167可以促进HBV增强子I指导的氯霉素乙酰化酶(CAT)的表达, 但是对于HBV其他的调节基因序列如X启动子序列、表面抗原基因启动子I、II, 以及增强子II和核心基因启动子等没有显著影响. 目前还没有MHBst167与DNA之间直接相互作用的证据, Caselmann et al[17]推测MHBst167的这种调节作用主要是通过对于肝细胞信号转导影响. 另外的研究还发现转录因子蛋白Sp1、AP1、NF-kB可以介导MHBst167的反式激活作用. 但是其他的转录因子如CREB、NF1、C/EBP等与MHBst167的反式激活作用无关. 这些研究结果表明MHBst167是一种具有多种生物学活性的反式调节蛋白.
HBxAg是一种具有多种生物学活性的反式激活作用蛋白[18-20]. 为了阐明HBxAg在HCC发生发展中的作用, Wu et al[21]利用表达HBxAg的腺病毒载体感染的新鲜的肝癌细胞进行基因表达系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE), 获得了19 501个表达序列标签, 代表了1 443个独立的基因, 是HBxAg反式激活作用的较为完整的表达谱研究. SAGE的结果也经过杂交分析证实, 其中57个基因的表达水平上调, 46个基因的表达水平下调, 表达水平的变化都在5倍以上. 上调的基因类型包括3种: 核糖体蛋白、具有锌指结构的转录因子蛋白, 以及与蛋白降解途径有关的蛋白类型. 因此认为HBxAg是一种具有多种生物学活性的调节蛋白, 包括蛋白的合成、基因表达的调节和蛋白的降解等.
Tarn et al[22]对HBxAg在肝细胞癌发生发展中的作用进行了研究. 选择的细胞系为来源于AML12的分化细胞系3pX-1以及去分化细胞系4pX-1, 在转染HBxAg之后分别发生恶性转化、不发生恶性转化. HBxAg表达载体转染之后只有4pX-1 细胞中的Stat3 信号被激活, 说明Stat3信号的激活与HBxAg的恶性转化作用无关. 最大程度的Stat3的激活过程需要其 Ser727位点的磷酸化修饰, 主要是有丝分裂原刺激信号介导的过程. 以显负性突变体或者有丝分裂原信号系统的抑制剂也可以抑制Stat3信号转导系统的激活. 如应用p38/MAPK的特异性抑制剂SB203580即可以抑制HBxAg依赖性的Stat3信号转导系统的激活. HBxAg只对4pX-1细胞中的p38/MAPK和Stat3具有激活作用, 而且p38/MAPK的激活过程是Ca2+、c-Src 依赖性的. HBxAg依赖性的p38/MAPK激活对于Cdc25C有磷酸化修饰和灭活作用, 磷酸化修饰的位点是Ser216, 因此激活的时机是G2/M检验点, 导致4pX-1细胞生长阻滞. 在低分化的肝细胞4pX-1中表达HBxAg可以激活在肝再生过程中活跃的信号转导系统. 这一研究结果表明, HBxAg在肝细胞中的表达, 影响不同的信号转导途径, 主要取决于肝细胞本身的分化状态[23-26].
Carretero et al[27]报道HBxAg可以激活转录因子蛋白激活T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NF-AT)这种免疫系统中重要的转录因子蛋白. 这一激活过程是钙/钙神经素(calcineurin)依赖性过程, 与这一转录因子蛋白的去磷酸化修饰以及细胞核内的转位过程有关. HBxAg与钙协同刺激NF-AT依赖性的转录过程, 说明HBxAg激活NF-AT还可能另有途径. 另外还发现HBxAg可激活NF-AT1转录因子蛋白的N-末端转录激活结构域(N-terminal transcription activation domain, TAD), 具体机制是通过蛋白-蛋白之间的相互作用. 将HBxAg定位在细胞核中表达, 并不影响其激活NF-AT1的功能. 但是, HBxAg分子中蛋白结合结构域的缺失突变则严重影响HBxAg对NF-AT1的反式激活作用[28-30].
Lee et al[31]构建了HBxAg的表达载体, 转染Chang X-34细胞系, 以Northern、Western blot方法检测白介素-18(IL-18)的表达. 应用流式细胞学技术对于细胞膜上的FasL表达水平进行检测. 发现HBxAg表达可以诱导IL-18的表达水平, FasL表达水平也相应升高. 如果以抗-IL-18的抗体阻断IL-18的活性, 则可以阻断HBxAg表达载体转染的肝细胞的FasL的表达, 说明HBxAg对于FasL的表达上调是通过 IL-18实现的. 在HBxAg转基因小鼠的肝细胞中也检测到了IL-18的表达[32-34].
HCV核心蛋白的序列相对保守, 在其分子结构中具有核定位信号(NLS), 在功能上不仅参与HCV病毒颗粒的形成, 而且具有多种生物学功能, 在HCV感染的肝细胞的细胞周期、细胞凋亡、信号转导等过程中, 都有十分重要的调节作用. Shrivastava et al研究了HCV核心蛋白的表达对细胞核转录因子的异常调节作用. 先前的研究发现肿瘤坏死因子a(TNFa)可以激活肝细胞中的转录因子NF-kB, 但是转染HCV核心蛋白的表达载体后, HCV核心蛋白的表达, 可以抑制TNFa对转录因子NF-kB的诱导能力. 转录因子NF-kB的诱导因素很多, 除了TNFa之外, 过氧化氢(H2O2)和美洲商陆(PMA)等都能诱导NF-kB的活性, 但是HCV核心蛋白的表达对由这些因素诱导的NF-kB的活性升高均具有显著的抑制作用[35-40]. 转录因子NF-kB向细胞核内的转位, 发生在IkBa磷酸化修饰和蛋白降解之后, 因此, 对HCV核心蛋白的表达对TNFa诱导的IkBa蛋白降解的影响也进行了研究. 正常情况下, TNFa诱导的IkBa蛋白降解一般在10-15 min, 在30 min时重新出现. 在表达HCV核心蛋白的细胞中几乎见不到IkBa蛋白降解现象. 因此, HCV核心蛋白可显著抑制TNFa诱导的IkBa蛋白降解, 可以解释HCV核心蛋白对于TNFa对转录因子NF-kB的诱导能力进行抑制的机制. IkBa蛋白降解过程, 需要有其蛋白分子中丝氨酸残基位点的磷酸化修饰, 因此, 推测HCV核心蛋白对于IkBa蛋白降解的抑制和TNFa对转录因子NF-kB的诱导能力的抑制, 可能是通过对于这一步蛋白磷酸化修饰来实现的[41-45].
肝细胞核中的另外一个转录因子蛋白就是AP-1, Shrivastava et al研究结果表明, HCV核心蛋白对AP-1具有激活作用. 已知TNFa对AP-1转录因子也具有激活作用, 因此研究了HCV蛋白表达对不同剂量的TNFa对于AP-1转录因子活性的诱导作用的影响. 在时效研究中发现, 受到TNFa的刺激之后, MCF-1细胞中的AP-1转录因子活性30 min开始出现, 并在2 h内达到高峰. 凝胶阻滞实验(EMSA)研究结果也证实了这一研究结果的AP-1转录因子的特异性. HCV核心蛋白表达时, MCF-1细胞中AP-1转录因子活性即已达到高峰, 受到TNFa的刺激之后不再升高. 为了排除HCV核心蛋白表达对AP-1转录因子激活的细胞特异性, 对于Hela、NIH3T3细胞系的研究结果也说明了同样的趋势[46-48].
JNK信号通路在肝细胞中也具有十分重要的地位和作用. TNFa对于JNK信号通路也具有显著的激活作用, 研究HCV核心蛋白表达影响TNFa对JNK信号通路的激活作用时发现, MCF-1细胞受到TNFa的刺激之后10-15 min, JNK转录因子活性开始升高, 但是表达HCV核心蛋白的细胞本身就具有较高的c-Jun激酶活性, 再受到TNFa的刺激之后, c-Jun激酶活性没有进一步的升高. 说明HCV核心蛋白表达激活了c-Jun激酶活性, 类似HCV核心蛋白诱导AP-1转录因子活性一样[49-50].
丝裂原激活蛋白激酶激酶(MAPKK)在激酶信号转导链中位于JNK激活的上游. 如果MAPKK缺陷, 其下游的JNK和AP-1转录因子活性就缺失. 已知TNFa可诱导MAPKK蛋白激酶活性. 因此, Shrivastava et al也研究了HCV核心蛋白的表达对MAPKK蛋白激酶活性的影响. 细胞受到TNFa的刺激后30-60 min, MAPKK激酶活性开始出现. 表达HCV核心蛋白的细胞系, 已经具备了较高的基础水平的MAPKK蛋白激酶活性, 再用TNFa进行诱导之后, MAPKK激酶活性没有进一步的升高. 说明HCV核心蛋白的表达对于MAPKK激酶活性具有显著的激活作用[51-54].
上述HCV核心蛋白对于转录因子的活性调节具有十分重要的意义, 因为NF-kB、AP-1、JNK和MAPKK在肝细胞中具有十分广泛而且重要的调节作用. 因此, HCV核心蛋白的表达对于上述4种转录因子蛋白或蛋白激酶活性具有调节作用, 说明HCV核心蛋白的表达可以通过对于这些调节因子的作用, 对于HCV感染的肝细胞产生十分广泛的作用[55-56].
HCV核心蛋白对肝细胞中2', 5'-寡腺苷酸合成酶(2', 5'-AS)基因转录水平具有激活作用. 病原体侵入人体之后, 通过其自身的一些成分, 抑制宿主细胞中的防御机制和抗病原体的机制, 有利于感染的形成和病原体的持续存在, 这是人与病原体长期共存形成的一种机制, 几乎是一个普遍的规律. 虽然2', 5'-AS是干扰素a(IFNa)诱导的主要的抗病毒蛋白类型, 但是发现HCV核心蛋白对于2', 5'-AS的基因转录活性具有显著的诱导作用. 在报告基因表达载体的构建和肝细胞转染实验研究中, Naganuma et al发现HCV核心蛋白的表达对干扰素刺激的应答元件(ISRE)信号转导途径具有显著的影响. 不同基因型的HCV核心蛋白对于2', 5'-AS基因启动子的转录活性均具有显著的激活作用, 但是HCV的E1、E2、NS5A等结构和非结构蛋白对于肝细胞中的2', 5'-AS基因启动子转录活性没有显著影响. 在PH5CH8细胞系受到500 U/ML的IFNa的刺激之后, 2', 5'-AS基因启动子转录活性提高约6倍, 当IFNa的剂量达到1000 U/ML时, PH5CH8细胞不再生长, 而且出现形态学改变. IFNa的刺激2', 5'-AS基因启动子转录活性的作用在6-12 h出现. 在其他类型的肝癌细胞系如HepG2、PLC/PRF/5中也得到了相似的结果. HCV核心蛋白编码基因的反义RNA表达载体的共转染实验研究表明, 反义RNA可以抑制HCV核心蛋白基因诱导的2', 5'-AS基因启动子转录活性[57-60].
HCV持续感染的形成有赖于HCV对于机体的免疫防御系统的抑制作用. Foy et al[61]的研究发现HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶对于干扰素调节因子-3(interferon regulatory factor-3, IRF-3)的磷酸化和功能的影响. NS3/4A蛋白酶结构位点的突变或者应用其蛋白酶活性的抑制剂即可以逆转其对于IRF-3的抑制作用. 另外, IRF-3的显负性突变体或者具有持续表达活性的IRF-3突变体, 分别具有增强或抑制 HCV RNA复制的作用. 因此, NS3/4A蛋白酶代表了一种重要的抗HCV NS3蛋白酶的重要的治疗靶点. 重新恢复IRF-3的表达活性可能是控制HCV感染的重要途径之一.
He et al[62]研究了羧基末端截短型NS3蛋白突变体在肝细胞肿瘤形成过程中的作用. 以这种截短型NS3蛋白的表达载体转染QSG7701细胞系, 以G418进行筛选之后, 以免疫细胞化学技术和聚合酶链反应(PCR)技术证实NS3基因的表达. 对于转染之后的细胞的增生能力、非接触式生长能力以及在裸小鼠体内形成肿瘤的能力进行研究. 发现在转染的细胞质中有高水平的HCV NS3蛋白的表达, 发现转染细胞的生长能力显著提高, 不仅可以称非接触式生长, 而且在接种裸小鼠之后的第 15 d可以形成肿瘤. 肿瘤组织中的c-myc蛋白表达水平也显著增多. 认为羧基末端截短型的HCV NS3具有显著的恶性转化作用, 而且这种转化作用可能与c-myc的表达水平升高有关[63-65].
HCV NS3蛋白在细胞增生和细胞凋亡的调节中也具有十分重要的作用. 但是, 长期以来这种调节作用的具体机制不十分清楚. Kwun et al[66]发现NS3蛋白特异性抑制肿瘤抑制基因p21基因启动子的转录表达活性, 而且是剂量依赖性的特点. NS3蛋白的这一特点不是细胞类型特异性的, 而且与核心蛋白之间也没有协同作用. NS3蛋白的这种抑制作用是p53依赖性的, 因为当 p21基因启动子序列中的p53结合位点缺失突变之后, NS3蛋白对于p21启动子转录活性的抑制作用完全消失. 另外, p21启动子序列中的p53 结合位点足以介导NS3 对于p21启动子转录活性的抑制作用. 表明NS3抑制p21启动子转录活性主要是通过对p53活性的调节实现的. NS3蛋白对于p21启动子转录活性的抑制作用的结构位点位于蛋白酶活性位点, 但是NS3蛋白的酶学活性并不是其抑制p21启动子转录活性所必需的. NS3蛋白对于p53基因的转录水平和蛋白的稳定性没有影响, 表明NS3蛋白通过与p53蛋白之间的相互作用机制来抑制p21的启动子转录活性. 表达NS3的细胞的生长速度是母本细胞的2倍, 说明NS3蛋白对于p21启动子转录活性的抑制结果造成了细胞增生速度的加快[67-68].
HCV NS5A蛋白的生物学功能目前还不十分清楚, 但是近几年来发现HCV NS5A蛋白与HCV感染后的IFNa抗性机制有关. 甚至在NS5A的编码基因区还鉴定出一段所谓的IFNa敏感决定区(ISDR), 近年来分子生物学机制的研究表明, NS5A蛋白与IFNa抗性有关的分子生物学机制, 可能是NS5A对于双链RNA激活蛋白激酶(PKR)的活性调节有关. 利用酵母双杂交技术发现NS5A蛋白与PKR蛋白结合, NS5A蛋白与PKR结合的位点恰好位于PKR的二聚体形成的位点, 即244-296 aa序列结构. 因此, NS5A蛋白对于PKR蛋白激酶活性的干扰机制, 至少部分是通过干扰PKR二聚体的形成来实现的. 也是通过酵母双杂交技术证实, 与PKR结合的NS5A结构, 与ISDR区相重叠. 但是也注意到, NS5A的ISDR区是NS5A蛋白与PKR结合的先决条件, 但不是全部条件. 临床上注意到HCV对于IFNa疗效的差别, 而且部分患者归结于NS5A蛋白序列的差别. 研究结果表明, 来源于IFNa不同敏感性的患者的HCV NS5A的ISDR序列不同, 这种序列的差别, 也影响到相应的NS5A蛋白与PKR蛋白之间的结合能力. 如果能够与PKR蛋白结合的NS5A蛋白的ISDR区发生突变, 那么就会严重影响NS5A-PKR蛋白之间的结合能力. 不只是与PKR蛋白之间的结合能力受到影响, NS5A蛋白的ISDR区的序列改变, 可以导致NS5A蛋白的生物学功能的丧失. 野生型的NS5A蛋白与PKR结合以后, PKR功能受到影响, 表现在eIF-2a磷酸化水平的降低, 从而导致蛋白合成水平升高, 细胞生长能力增加. 在ISDR区进行多个位点的基因突变之后, 严重影响其与PKR蛋白之间的结合, 并导致功能的丧失. 在酵母细胞中如此, 在哺乳动物细胞中的研究结果也是如此[69-72].
HCV NS5A蛋白对于肝细胞中的信号转导的影响, 还包括改变细胞内钙离子的浓度、诱导氧化应激、激活转录因子Stat3和NF-kB等. Gong et al利用EMSA技术, 研究了NS5A蛋白对于细胞转录调节的影响. 研究的对象包括NF-kB、AP-1、Stat-3和Oct-1等. 结果表明NS5A蛋白的表达可以激活NF-kB、Stat-3. NS5A蛋白对于Stat-3的激活作用具有不寻常的意义, 因为一般情况下是白介素-6(IL-6)、表皮生长因子(EGF)等生长因子能激活Stat-3的转录. 对于表达NS5A蛋白的细胞中的Stat-3蛋白的酪氨酸磷酸化状态进行研究, 发现NS5A蛋白可以激活Stat-3. 但是NS5A的缺失突变体却不具备这样的功能. Gong et al用NF-kB识别的保守序列的串联启动子的报告基因表达载体的构建和细胞转染技术, 研究了NS5A蛋白对于NF-kB依赖性的转录调节机制[72-74].
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