肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白基因筛选

摘要

目的: 筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S蛋白相互作用蛋白的基因, 探讨前-前-S在HBV致病中的作用．

方法: 构建前-前-S的酵母细胞表达载体, 采用酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库, 利用核苷酸数据库及生物信息学技术, 对于筛选结果进行分析．

结果: 获得了54个与前-前-S蛋白特异性结合的阳性克隆, 其中包括30种已知蛋白基因和8个未知功能基因．

结论: 克隆出与乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合的肝细胞蛋白基因, 为进一步研究前-前-S在HBV致病中的作用奠定了基础．

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 28, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: December 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)感染常见, 不仅引起急、慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化(LF)、肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关[1-12]. HBV是很小的包膜病毒, 病毒基因组结构精密, 约3 200个碱基对(bp), HBV至少有含4个开放读码框架(ORF), 分别命名为S、C、P、X区, 4个ORF中表达的氨基酸长度不同, 其生物学功能也不相同, 其中全S区又因不同的起始密码子(ATG)而又人为的分为前-S1、前-S2和S三个区, 前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白是按照同一开放读码顺序(in frame)进行翻译的. 最近董菁et al[13]对于中国HBV流行株的全基因序列进行克隆和序列分析, 发现在前-S1区之前还存在一个ORF, 长度135 bp, 编码45 aa, 将其命名为前-前-S区, 并在既往已克隆的HBV基因组中得到了证实. 杨倩et al[14]对前-前-S基因启动子序列的鉴定和转录活性的研究证实, 前-前-S-基因ORF上游的序列具有启动子活性, 进一步证实了董菁发现的前-前-S编码基因存在. 基因是通过蛋白质之间的相互作用而实现其功能的, 病毒蛋白和肝细胞蛋白之间的作用是病毒致病的关键[15-16]. 为进一步研究前-前-S-基因在HBV致病中的作用, 我们利用酵母双杂交技术寻找其与肝细胞中相互作用的蛋白, 并进一步探明其作用机制, 这对于明确HBV致病机制, 有效防治乙型肝炎有着重要意义.

1 材料和方法

1.1 材料

pGBKT7-BD克隆载体, Saccharomyces cerevisiae AH109酵母株、Y187酵母株(K1612-1)、人cDNA肝细胞文库等均购自Clontech公司. 酵母YPDA培养基、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基, X-α-半乳糖苷酶(Gal)等购自Clontech公司, 半硫酸腺苷、醋酸锂购自Sigma公司. 复杂高效感受态(FSB), 本室自制. 大肠杆菌(DH5α), 本室保存.

1.2 方法

1.2.1 肝细胞文库的扩增与转化: 按照文库扩增手册操作滴定肝细胞文库原液, 欲达到3×10¹² cfu/L, 于LB-Amp琼脂平板进行扩增, 刮取收集菌液, 以Qiagene Maxi试剂盒提取质粒DNA, 高效醋酸锂法转入酵母细胞Y187, 于SD/Leu琼脂培养基生长扩增, 同时滴定转化文库, 收集酵母菌落, 以1×10⁶ /份分装备用.

1.2.2 诱饵质粒载体的构建及酵母配合实验: 用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV前-前-S蛋白编码基因, 连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒, 酶切鉴定后, 用醋酸锂法转入酵母细胞AH109. 挑取2-3 mm大小在SD/-Trp培养基上生长的转化了pGBKT7-前-前-S质粒的酵母AH109单菌落接种于SD/-Trp培养基中, 30 ℃ 250 r/min振摇过夜, 次日离心后用2×YPDA培养液5 mL重悬细胞, 计数浓度大于1×10¹² /L, 与肝细胞文库酵母细胞在50 mL 2×YPDA中30 ℃轻摇配合约22 h, 离心后用0. 25×YPDA 8 mL重悬细胞, 分别铺板于150 mm的SD/-Trp/-Leu/-His(3缺), SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade(4缺)培养基板各25块上, 同时将配合产物按1:100、1:1 000、1:10 000铺于SD/-Trp、SD/-Leu及SD/-Trp/-Leu培养基上检验配合效率. 生长6-18 d后挑取直径大于3 mm的菌落再次画线于铺有X-α-gal的4缺培养基上检查α-半乳糖苷酶活性, 认为在此培养基上能生长且变成蓝色的为真阳性菌落.

1.2.3 阳性质粒的克隆和分析: 挑取真正的阳性集落按照试剂盒提供的操作指南Lyticase法提取酵母质粒. 提取的质粒以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠杆菌, 于含有氨苄青霉素的SOB平板培养, 所获得的菌落酶切鉴定后测序. 阳性克隆DNA测序后, 提交GenBank比对, 进行生物信息学分析, 并把所获新的基因序列存入GenBank数据库.

2 结果

2.1 部分筛选克隆BglⅡ酶切鉴定结果

因质粒pACT2内含有两个BglⅡ酶切位点, 分别位于多克隆位点两侧, 故使用该内切酶消化将释放出所筛选到的肝细胞文库的基因片段(图1). 图1中出现的各个大小不同的DNA片段表明我们筛选的克隆为阳性克隆.

图1 部分不同的克隆Bgl Ⅱ酶切鉴定电泳图谱. 1, 8: 分别为DNA2000 marker及DNA15000 marker; 2-7: 为不同的克隆酶切电泳结果.

2.2 cDNA测序与同源性分析初步结果

我们共挑选54个阳性克隆测序, 测序结果与GenBank数据库进行初步比较, 其中8个克隆为未知功能基因, 其余46个均与已知基因序列高度同源(96-100%), 详细结果(表1).

表1 肝细胞中前-前-S蛋白结合的蛋白类型.

筛选出的目的基因	相同克隆数	同源性(%)
人类醛缩酶B	9	99-100
人类金属硫蛋白2A	4	99-100
人类铁蛋白轻链	3	97-100
人类转铁蛋白受体2α	1	99
人类金属蛋白酶组织抑制因子1	2	99
人类成纤维细胞生长因子受体4	1	99
人类精氨酸酶(肝)	2	100
人类补体C8α亚单位	1	99
人类补体C8β亚单位	1	100
人类核孔p54蛋白质	1	100
人类羧酸酯酶1(单核细胞/巨噬细胞丝氨酸酯酶1)	1	99
人类羟酰辅酶A脱氢酶	1	99
人类细胞色素C氧化酶Ⅱ	1	99
人类细胞色素P-450 s-甲基乙苯妥英-4-羟化酶	1	99
细胞色素P-450(家族2, 亚家族E)	2	99
人类支链alpha酮酸脱氢酶激酶前体	1	98
人类氨基己糖酯(苷)酶A(α多肽)	1	99
人类苯丙氨酸羟化酶	1	99
人类NADH脱氢酶(辅酶Q10)β亚成分	1	98
人类乙酰乳酸合酶同功酶	1	99
人类高半胱氨酸甲基转移酶2	1	98
人类3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶	1	99
人类谷氨酸氨连接酶	1	100
人类alpha-2糖蛋白1(人类锌alpha-2糖蛋白)	1	99
人类蛋白酶体26S亚单位	1	100
人类视黄醇结合蛋白4	1	100
人类锌alpha2糖蛋白	1	96
人类酶原颗粒蛋白16	1	100
人类DAZ相关蛋白2	1	98
人类RNA聚合酶Ⅱ羧基末端结构域(CTD)小磷酸酯酶2	1	100
未知功能基因	8	98-100

3 讨论

董菁et al[17-19]利用长距离精确聚合酶链反应(LA-PCR)和TA克隆-测序技术展示了同一患者来源的HBV基因组不同克隆之间的变异程度, 证明患者血清内的序列是不完全相同的, 符合准种表现. 董菁et al[13]在分析所获得的5个克隆的过程中, 在前-S1区之上游发现还存在一个ORF, 长度135 bp, 编码45 aa, 并将其命名为前-前-S区. 选择的GenBank中6个其他克隆株进行比较, 其中3个克隆具有前-前-S区ORF, 另3个克隆由于在前-前-S起始密码子的部位发生点替换突变而导致前-前-S区不能表达. 董菁在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列, 应用DNASIS软件重新确定其ORF, 结果发现甘人宝et al[20]、Mukaide et al[21]、Okamoto et al[22]克隆的HBV基因组序列中均存在前-前-S区ORF. 同时利用NIH网站的BLAST软件, 将前-前-S区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索, 结果发现5个克隆中含有的氨基酸序列与董菁获得的序列有较高的同源性, 由此认为前-前-S区是真实存在的.

HBV表面抗原不仅是病毒遗传结构的包装蛋白, 而且截短型表面抗原中蛋白和大蛋白具有反式激活作用[13], 这种功能是与表面抗原的多种形式激活癌基因有关[23], 董菁进一步应用DNA SIS软件的蛋白质分析功能分析了前-前-S、前-S1、前-S2和S基因的完全表达产物, 前-前-S区较以往认为的大蛋白多出一个小的疏水区, 那么全S蛋白(含前-前-S区)与大蛋白有不小的差异. 其中的19(21)个疏水氨基酸在前-前-S区形成了一个小的疏水功能域, 可能与蛋白的空间折叠或表面蛋白合成后分泌有关. 进一步研究前-前-S所编码蛋白的功能及与之相互作用的蛋白具有重要意义.

我们应用酵母双杂交技术成功的筛选出肝细胞文库中与前-前-S蛋白相互作用蛋白, 共获得54个阳性克隆, 经过测序分析及与GenBank数据库进行比较, 其中8个克隆为未知功能基因, 其余46均为已知蛋白基因, 值得我们关注的是筛选到一些与肝损伤及肝纤维化有关的蛋白基因. 已有的研究显示, 铁代谢异常与肝损伤密切相关, 有报道铁过载可增加HBV所致的肝细胞损害. 铁是DNA、RNA和蛋白质合成的必须辅助因子, 病毒侵入肝细胞后, 就利用细胞的蛋白质和核酸的合成机制进行复制, 细胞内铁可能参与了这个过程, 从而有利于病毒的复制进一步造成肝损伤; 铁及其结合蛋白具有免疫调节功能, 铁过量或缺乏可破坏免疫调节的平衡, 导致严重的有害的生理效应[24]. 表明HBV感染的发病与铁代谢可能有一定的联系. 进一步的研究还发现, 体内铁含量与干扰素(IFN)疗效密切关系, 血清铁蛋白水平与IFN疗效明显负相关, 高血清铁蛋白水平的患者对IFN疗效较差[25]. 转铁蛋白受体(TfR)是一种跨膜二聚体糖蛋白, 其功能是与Fe-Tf(转铁蛋白)复合物结合后通过Tf循环将铁从细胞外转运到细胞内. 转铁蛋白是血液中一种主要的糖蛋白, 负责将肝组织(是铁贮藏的主要场所)的铁向其他组织的细胞运输. TfR是细胞摄入铁的关键, 他表达的数量直接影响细胞的摄铁量. 我们的研究发现前-前-S蛋白可与铁代谢有关的两个关键蛋白(铁蛋白及转铁蛋白受体)相互作用, 推测HBV感染致肝损伤可能与HBV感染致铁代谢障碍有关, 为HBV感染致肝损伤机制的研究开辟了新的思路.

另外值得我们关注的是人类金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1), 在肝纤维化过程中TIMP-1通过对基质金属蛋白酶(MMPs, 主要是间质胶原酶即MMP-1)活性的抑制, 抑制了Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质(ECM)的降解, 从而导致ECM在肝脏内的过度沉积, 促进了肝纤维化的形成和发展. 研究者发现在病损肝脏中TIMP-1的表达明显增高, TIMP-1与肝纤维化的发生发展紧密相关[26-27]. 黄宇琦et al的动物实验表明, 肝纤维化发生发展过程中TIMP-1表达逐渐增强, 致二者的平衡被破坏, 大量TIMP-1的出现使间质胶原酶(人MMP-1, 大鼠MMP-13)MMP-13失去活性, 造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少、沉积增多, 促进了肝纤维化、肝硬化的形成[28]. 杨长青et al研究发现, 反义TIMP-1对肝纤维化有一定的逆转作用[29]. 我们的研究发现, 前-前-S蛋白能与人类金属蛋白酶组织抑制因子1结合, 这一结果将为HBV感染引起肝纤维化机制研究提供新的领域. 实验还筛选到补体8α及补体8β亚单位, 提示前-前-S蛋白可能通过补体途径影响免疫系统功能, 为研究HBV免疫损害方面的机制提出了新的思路.

除上述结果外, 我们还筛选到多种能与前-前-S蛋白结合的蛋白, 表明前-前-S蛋白可能具有广泛的作用, 通过多种机制参与HBV感染的致病过程, 其具体的作用机制尚需进一步研究.

备注

编辑:N/A

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