基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-12-15; 12(12): 2792-2796
在线出版日期: 2004-12-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i12.2792
大肠腺瘤及癌组织HIF-1α的表达与凋亡增生的关系
程胜平, 刘南植, 钱颉
程胜平, 刘南植, 钱颉, 华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科 湖北省武汉市 430030
程胜平, 男, 1972-04-12生, 湖北省武汉市人, 汉族, 2002级华中科技大学同济医学院硕士生, 主要从事消化道肿瘤的基础及临床研究.
通讯作者: 程胜平, 430030, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科. sheng_ping2004@sina.com
电话: 027-83663208
收稿日期: 2004-10-18
修回日期: 2004-11-20
接受日期: 2004-11-27
在线出版日期: 2004-12-15

目的: 研究缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)在大肠肿瘤中的表达及其与凋亡、增生的关系, 探讨HIF-1α在大肠癌发生发展中的作用.

方法: 运用免疫组化的方法检测HIF-1α, Bcl-2, Bax, PCNA在正常大肠组织13例, 大肠腺瘤26例, 大肠癌50例中的表达.

结果: 正常大肠组织HIF-1α均为阴性表达, 腺瘤及癌组织中HIF-1α阳性表达率为30.8%和64%, 大肠癌HIF-1α表达率显著高于腺瘤(χ2 = 8.546, P<0.01). 大肠癌HIF-1α表达与浸润, 淋巴结转移, Dukes分期相关(χ2 = 6.339, P<0.05; χ2 = 9.091, P<0.01; χ2 = 10.72, P<0.05). HIF-1α表达与肿瘤大小、分化程度无关(P>0.05). Bcl-2在3组中阳性表达率为15.4%, 50.0%和76.0%, 三者间表达率差别有显著意义(P<0.05). Bax在3组中阳性表达率为76.9%, 65.4%和58.0%, 三者间表达率无显著性差异(P>0.05). Bcl-2, Bax表达与肿瘤大小, 分化, Dukes分期无关(P>0.05). 正常大肠组织PCNA表达均为低增生活性, 腺瘤及癌中PCNA高增生活性者26.9%和56.0%, 癌组织PCNA高增生活性表达显著高于腺瘤(χ2 = 5.073, P<0.05). 大肠癌增生程度与浸润及Dukes分期相关(χ2 = 6.336, P<0.05; χ2 = 11.219, P<0.01). 腺瘤及大肠癌HIF-1α表达与Bcl-2, PCNA增生程度呈正相关(r = 0.5, r = 0.535, P<0.05; r = 0.457, r = 0.426, P<0.01), 与Bax表达无关.

结论: HIF-1α抑制大肠肿瘤凋亡, 促进增生, 与肿瘤浸润转移密切相关, 在大肠癌发生发展中发挥重要作用.

关键词: N/A
引文著录: 程胜平, 刘南植, 钱颉. 大肠腺瘤及癌组织HIF-1α的表达与凋亡增生的关系. 世界华人消化杂志 2004; 12(12): 2792-2796
Expression of HIF-1α and its relations with apoptosis and proliferation in colorectal neoplasm
Sheng-Ping Cheng, Nan-Zhi Liu, Jie Qian
Sheng-Ping Cheng, Nan-Zhi Liu, Jie Qian, Department of Gastroenterology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Correspondence to: Sheng-Ping Cheng, Department of Gastroenterology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China.
Received: October 18, 2004
Revised: November 20, 2004
Accepted: November 27, 2004
Published online: December 15, 2004

AIM: To study the expression of HIF-1α and its relationship with apoptosis and proliferation in human colorectal neoplasm

METHODS: Expression of HIF-1α, Bcl-2, Bax and PCNA was detected in normal colorectal tissue (n = 13), colorectal adenoma (n = 26) and adenocarcinoma (n = 50) by the immunohistochemical method respectively.

RESULTS: HIF-1α was negatively expressed in normal colorectal mucosa tissues. The positive rate of HIF-1α expression was significantly higher in adenoma tissues than that in adenocarcinoma ones (30.8% vs 64.0%, χ2 = 8.546, P < 0.05). The expression of HIF-1α in colorectal carcinoma significantly related to the depth of invasion, lymph node metastasis, and Dukes staging (χ2 = 6.339, P < 0.05; χ2 = 9.091, P < 0.01; χ2 = 10.72, P < 0.05). No significant correlation was found between the positive rate of HIF-1α and tumor's size and differentiation (P > 0.05). The positive rate of Bcl-2 expression in three groups was 15.4%, 50.0% and 76.0% respectively, and there were significant differences among them (P < 0.05). The positive rate of Bax expression was 76.9%, 65.4% and 58.0% in three groups respectively. There were no significant differences among them. The proliferation level of carcinoma is higher than that of adenoma (χ2 = 5.073, P < 0.05) and it was related to the depth of invasion and Dukes staging (χ2 = 6.336, P < 0.05; χ2 = 11.219, P < 0.01). HIF-1α expression was positively associated with Bcl-2 and PCNA levels in adenoma and carcinoma (r = 0.5, r = 0.535, P < 0.05; r = 0.457, r = 0.426, P < 0.01).

CONCLUSION: Over-expression of HIF-1α is associated with apoptosis inhibition, proliferation, invasion and metastasis of colorectal neoplasm, and it may play an important role in the caicinogenesis and development of colorectal carcinoma.

Key Words: N/A
0 引言

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是迄今为止发现惟一的低氧状态下发挥活性的转录因子. HIF-1是由HIF-1α及HIF-1α组成的异二聚体, 其中α亚单位被认为是特异性氧调节亚单位, 决定了HIF-1的活性. 人类实体肿瘤中常存在缺氧环境, 已在多种恶性肿瘤甚至癌前病变中检测到HIF-1α过表达[1-7]. HIF-1α参加了肿瘤对低氧的适应过程, 从而增强了肿瘤细胞对缺氧的抵抗能力, 促进肿瘤细胞的生长及恶性转化[8-12]. 研究表明, HIF-1α在缺氧介导的凋亡及增生中起重要作用, 但目前关于HIF-1α与凋亡、增生的关系报道不一[13-15]. 大肠癌是常见的恶性肿瘤, 研究认为凋亡及增生的失衡在大肠黏膜癌变中起着重要作用. 关于HIF-1α与大肠肿瘤凋亡及增生的研究较少. 我们通过免疫组化的方法检测HIF-1α, Bcl-2, Bax, PCNA在正常大肠黏膜, 腺瘤及腺癌中的表达, 探讨大肠肿瘤临床病理及HIF-1α与凋亡及增生的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

2000/2003年大肠腺癌50例, 男28例, 女22例, 年龄34-67(52.9±10.6岁). 高分化17例, 中分化24例, 低分化9例. Dukes A 11例, B 11例, C 18例, D 10例. 大肠腺瘤26例, 管状腺瘤10例, 绒毛状腺瘤9例, 管状-绒毛状腺瘤7例. 另13例正常大肠组织作对照. 石蜡切片厚5 μm. 兔抗人HIF-1α多抗(1:80)及SABC试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司), 鼠抗人Bcl-2, Bax, PCNA单抗(1:100, 北京中山试剂公司).

1.2 方法

采用免疫组化方法检测. HIF-1α免疫组化染色采用SABC法, Bcl-2, Bax, PCNA采用SP法. 染色步骤按试剂盒说明进行, 染色前用柠檬酸抗原修复液热水浴或微波抗原修复10 min. 用PBS代替一抗作阴性对照, 已知阳性切片作阳性对照. HIF-1α蛋白以胞质或胞核内有棕黄色颗粒为阳性, 高倍镜下(×400)对每张切片随机选择5个视野, 计数200个细胞/视野, 共计1 000个, 阳性细胞数<1%为阴性(-), 阳性细胞数1-10%为弱阳性(+), 11-50%为中度阳性(++), >51%为强阳性(+++)[13]. Bcl-2和Bax蛋白均以胞质内有棕黄色颗粒为阳性. 判定标准: 无阳性反应为阴性(-), 阳性细胞数<5%为弱阳性(+), 6-50%为中度阳性(++), >51%为强阳性(+++). PCNA以胞核内有棕黄色颗粒为阳性, <5%为阴性, 6-25%为(+), 26-50%(++), 51-75%(+++), >76%(++++), 以+++, ++++级为高增生活性, 以此作为大肠肿瘤的增生程度指标.

统计学处理 根据数据性质, 采用χ2检验, Fishers精确概率法, 及Spearman等级相关分析, 所有数据在SPSS12.0软件进行, 显著水平取α = 0.05.

2 结果
2.1 HIF-1α, Bcl-2, Bax, PCNA的表达

HIF-1α蛋白主要表达于胞质, 也有部分胞核表达. 正常大肠组织HIF-1α均为阴性表达, 腺瘤中阳性表达率为30.8%(8/26), 癌组织中阳性表达率为64.0%(32/50). 腺瘤中HIF-1α阳性表达率高于正常组织(χ2 = 7.483, P<0.05), 腺癌HIF-1α阳性表达率显著高于腺瘤(χ2 = 8.546, P<0.01). Bcl-2及Bax表达于胞质. Bcl-2在正常组织, 腺瘤, 癌组织中阳性表达率为15.4%, 50.0%, 76.0%, Bcl-2的阳性表达率正常组织<腺瘤<癌组织, 三者之间表达率差别有显著意义(P<0.05). Bax在三者中阳性表达率为76.9%, 65.4%, 58.0%, 呈逐渐下降趋势, 但经统计分析, 三者间表达率无显著性差异(P>0.05). PCNA表达于细胞核. 正常大肠组织PCNA表达均为低增生活性, 腺瘤中PCNA高增生活性者26.9%(7/26), 癌组织中高增生活性56.0%(28/50). 腺瘤中高增生活性表达率虽高于正常组织, 但其差异无显著性(P = 0.07, Fishers精确概率), 癌组织中PCNA高增生活性表达显著高于腺瘤(χ2 = 5.073, P<0.05, 表1, 图1A-F).

表1 HIF-1a, Bcl-2, Bax, PCNA的表达(n, %).
分组nHIF-1α
Bcl-2
Bax
PCNA
-+-+-+低高
正常13130112(15.4)310(76.9)130
腺瘤26188(30.8)1313(50.0)917(65.4)197(26.9)
癌组织501832(64.0)1238(76.0)2129(58.0)2228(56.0)
图1
图1 大肠腺瘤及腺癌组织HIF-1α, Bcl-2, PCNA免疫组化表达. A: 腺瘤HIF-1α阳性×400; B: 腺瘤Bcl-2阳性×400; C: 腺瘤PCNA阳性×200; D: 中分化腺癌HIF-1α阳性×200; E: 中分化腺癌Bcl-2阳性×200; F: 中分化腺癌PCNA阳性×200.
2.2 HIF-1α, Bcl-2 , Bax, PCNA 表达与大肠癌临床病理特征联系

HIF-1α阳性表达率与大肠癌的大小, 分化程度无关(P>0.05). 浸润浆膜及有淋巴结转移者HIF-1α阳性表达率高于未浸润浆膜(χ2 = 6.339, P<0.05)及无淋巴结转移者(χ2 = 9.091, P<0.01), 随着Dukes分期进展, HIF-1α表达增高, 各期HIF-1α表达率有显著性差异(χ2 = 10.72, P<0.05). PCNA增生程度与肿瘤的大小及分化程度无关(P>0.05), 浸润浆膜者增生程度高于未浸润浆膜者(χ2 = 6.336, P<0.05), 有淋巴结转移者增生活性高于无淋巴结转移者, 其差异处于统计学临界范围(χ2 = 3.63, P = 0.057). 随着Dukes分期进展, PCNA增生程度增高, 各期PCNA增生程度差异具显著性(χ2 = 11.219, P<0.01). Bcl-2, Bax在大肠癌中的表达与肿瘤的大小、分化及Dukes分期无明显相关(P>0.05, 表2).

表2 HIF-1α, Bcl-2, Bax, PCNA表达与大肠癌临床病理特征联系.
临床病理特征nHIF-lα
Bcl-2
Bax
PCNA
-+-+-+低高
肿瘤大小:<3 cm1661031361079
3-5 cm207135158121010
>5 cm14594107759
分化程度:高1761161141389
中2481642012121113
低945275436
浸润浆膜:(-)1183385692
(+)391029a93016231326a
淋巴结转移:(-)22139517616139
(+)28523b7211513919
Dukes分期:A1183385692
B1156292956
C1841451399711
D1019a285519b
aP<0.05,
bP<0.01.
2.3 HIF-1α表达与大肠肿瘤凋亡及增生的关系

在大肠腺瘤中, HIF-1α表达与Bcl-2, PCNA增生程度呈正相关(r = 0.5, r = 0.535, P<0.05), 与Bax表达无关(r = 0.135, P>0.05). 在大肠癌中, HIF-1α表达与Bcl-2表达呈正相关(r = 0.457, χ2 = 8.315, P<0.01), 与PCNA增生程度呈正相关(r = 0.426, χ2 = 9.091, P<0.01), 与Bax表达无关(r = -0.132, χ2 = 0.867, P>0.05, 表3).

表3 腺瘤, 大肠癌HIF-1α表达与凋亡及增生关系.
HIF-1αBcl-2
Bax
PCNA
-+-+低高
腺瘤-126711162
+17a2635a
大肠癌-99612135
+329b1517923b
aP<0.05,
bP<0.01.
3 讨论

缺氧是实体肿瘤常见现象, 能诱导一系列与血管新生, 无氧代谢等密切相关的基因, 帮助肿瘤细胞适应缺氧环境. 在此过程中起关键作用的是HIF-1α. HIF-1α过表达与肿瘤的浸润转移、预后、治疗抵抗密切相关[16-19]. 本结果显示, HIF-1α在正常大肠组织中无表达, 在腺瘤中阳性表达率为30.8%, 在癌组织中表达率为64.0%, 三者之间表达率差异有显著性. HIF-1α表达水平在正常组织-腺瘤-腺癌中不断增高, 这与江从庆et al[20], Jiang et al[21]结果一致. 这表明细胞缺氧出现在癌变之前并持续到肿瘤发展的全过程, HIF-1α过表达可能是癌变过程中的早期行为, 提示HIF-1α过度表达在促进腺瘤癌变中发挥重要作用. 我们还发现, 浸润浆膜, 有淋巴结转移者HIF-1α阳性表达率高于未浸润浆膜及无淋巴结转移者, 且随着Dukes分期进展, HIF-1α表达率逐渐增高, 表明HIF-1α在大肠癌的浸润, 转移中起重要作用.

Bcl-2是公认的抗凋亡基因, Bax基因通过拮抗Bcl-2基因而发挥其促进细胞凋亡的作用, Bcl-2/Bax比值与细胞凋亡率显著相关. Bedi et al[22]研究表明在大肠黏膜癌变过程中细胞凋亡能力逐渐减弱. 於亮亮et al[23]研究, 在结肠癌变过程中, 从腺瘤病变到癌, Bcl-2表达逐渐增高, 凋亡指数相应降低. 说明Bcl-2异常表达是大肠癌变过程细胞凋亡受抑制的潜在机制. 我们也发现, 在正常大肠组织, 腺瘤, 癌组织中Bcl-2表达逐渐增高, 三组表达有显著性差异, 而Bax表达有逐渐降低趋势, 表明在大肠腺瘤-癌变序列中, 细胞凋亡受抑制. PCNA是DNA聚合酶的辅酶之一, 可作为细胞周期内S期的特异性标志和评价细胞增生状态的一个指标[24]. 本结果显示, 腺瘤细胞增生活性较正常黏膜增加, 而癌组织又较腺瘤明显增加, 从腺瘤到癌发展过程中, 细胞增生持续增加.

HIF-1α在低氧诱导的凋亡与肿瘤增生中起重要作用. 但关于缺氧及HIF-1α是促进或抑制凋亡目前报道不一[25-27]. 目前关于HIF-1α与大肠肿瘤凋亡关系报道较少. 我们观察了HIF-1α在大肠腺瘤及癌中的表达及其与Bcl-2, Bax表达的关系, 结果显示HIF-1α, Bcl-2表达从腺瘤到癌逐渐增多, 且HIF-1α表达在腺瘤及癌中均与Bcl-2呈正相关, 与Bax表达无关. 这提示HIF-1α表达与大肠肿瘤凋亡抑制有关, 在大肠腺瘤-癌演变过程中, HIF-1α通过抑制细胞凋亡从而促进大肠腺瘤的恶性转化过程. 大肠肿瘤中缺氧及HIF-1α调控凋亡机制尚不明确. Kinoshita et al[28]在人结肠癌细胞系HCT116培养中发现, 缺氧培养24 h后, 肿瘤细胞Bcl-2表达上调, 持续缺氧培养48 h后, Bcl-2表达较前更加增高, 且同时伴有PCNA高表达. 认为缺氧可上调Bcl-2表达从而使肿瘤细胞抵御缺氧所致的凋亡而继续生长. Wang et al[29]也报道, 缺氧培养的HTDEC细胞(human tumor-derived endothelial cells, 分离自结肠癌)Bcl-2表达上调从而使HTDEC细胞抵抗IFN-α诱导的凋亡, 并认为缺氧上调Bcl-2是通过HIF-1α介导. 有研究表明, VEGF表达上调可以促进Bcl-2表达从而抵御缺氧所致的凋亡[30-32]. VEGF是HIF-1α最重要的调控基因, 研究已表明在大肠肿瘤中HIF-1α诱导VEGF表达上调. 可见HIF-1α可能与其他基因一起参与对凋亡的调控. 樊利芳et al[13]发现在肺癌中HIF-1α与bcl-2呈负相关, 而与bax正相关, 与本研究不一致, 可能与不同的肿瘤组织类型有关.

本实验结果显示PCNA增生活性在正常黏膜-腺瘤-癌中逐渐增高, 且PCNA高增生活性与大肠癌浸润, Dukes分期有关. 这与陈卫昌et al[33]研究结果一致. 提示PCNA可作为判断大肠癌浸润转移的指标. Kinoshita et al[28]在大肠癌HCT116细胞系缺氧培养发现PCNA高表达. 本实验结果也显示HIF-1α表达与腺瘤及癌组织PCNA 增生活性呈正相关, 提示HIF-1α过表达可促进肿瘤组织增生. HIF-1α促进肿瘤细胞增生可能与HIF-1α促进VEGF, IGF-1, IGF-2等基因表达有关.

总之, 大肠肿瘤组织局部缺氧, HIF-1α表达上调, 诱导其下游基因表达, 使肿瘤细胞适应缺氧环境, 反过来又抑制缺氧所致的凋亡及促进增生, 使凋亡/增生进一步失衡, 从而最终导致癌变发生发展.

编辑:N/A

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