研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-11-15; 12(11): 2757-2761
在线出版日期: 2004-11-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i11.2757
应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因
张黎颖, 邓红, 成军, 党晓燕, 刘妍, 蔺淑梅, 黄燕萍, 纪冬, 吴顺华, 纪泛扑, 邵清
张黎颖, 邓红, 党晓燕, 纪泛扑, 西安交通大学第二医院感染科 陕西省西安市 710004
成军, 刘妍, 蔺淑梅, 黄燕萍, 纪冬, 吴顺华, 邵清, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 北京市中国人民解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-05-28
修回日期: 2004-09-13
接受日期: 2004-09-30
在线出版日期: 2004-11-15

目的: 应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因.

方法: 构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP13, 应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.

结果: HepG2细胞经转染NS5ATP13后, 有86条差异基因表达, 其中46条基因表达增强, 40条基因表达降低. 这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关.

结论: 应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因, 为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

关键词: N/A

引文著录: 张黎颖, 邓红, 成军, 党晓燕, 刘妍, 蔺淑梅, 黄燕萍, 纪冬, 吴顺华, 纪泛扑, 邵清. 应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(11): 2757-2761
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: May 28, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: November 15, 2004

N/A

Key Words: N/A


0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒属, 是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒. 在大多数感染人群中丙型肝炎病毒表现为持续性感染, 并可导致慢性肝炎、肝硬化, 或肝细胞癌, 而且与肝脏脂肪变、糖代谢紊乱有关[1-10]. 其基因组含有单一的开放读码框架, 编码3 010-3 033个氨基酸残基(aa)的多肽前体, 两侧是5'-非翻译区及3'-非翻译区. 因为HCV的基因复制形式没有经过DNA阶段, 不存在HCV基因组与肝细胞基因组DNA的整合, 所以, HCV主要是通过基因组编码蛋白和肝细胞蛋白之间的相互作用及肝细胞蛋白与HCV调节基因的相互作用造成对肝细胞的损伤. 其多肽前体至少被加工为十种结构蛋白和非结构蛋白, 其中非结构蛋白NS5A基因(位于6 258-7 601 nt之间)编码的56 ku的NS5A蛋白(448 aa)具有多种生物学功能, 在HCV多蛋白的成熟和RNA的复制过程中具有十分重要的作用[11-14]. 研究报道, NS5A上存在干扰素α敏感决定区(ISDR), 与干扰素治疗的敏感性相关[15-16]; 此外, NS5A还是一种作用很强的基因转录激活因子[17-21], 调控着细胞内许多病毒及细胞基因的转录, 与感染HCV的细胞发生恶性转化过程有关, 我室已证明他可以反式激活SV40早期启动子/增强子[21], 并应用抑制性消减杂交技术(SSH)对NS5A的反式调节基因进行了初步的研究[22]. NS5ATP13是我室利用SSH从分别转染真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A和pcDNA3.1(-)空载体的HepG2细胞中筛选出来的, 经过PCR扩增, TA克隆, 测序鉴定证实, 已在GenBank上注册成功, 注册号为AY820769. NS5ATP13基因的编码序列全长为2 103个核苷酸(nt), 编码产物由700 aa组成. 本研究为了进一步阐明HCV的致病机制, 应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)[23-24]. 对于HCV的NS5A TP13反式调节的靶基因成功地进行了筛选, 为今后更加广泛深入地研究HCVNS5A在HCV的致病机制中的作用及新基因NS5ATP13的生物学功能提供线索.

1 材料和方法
1.1 材料

人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞由本室保存, 细胞培养相关试剂及总RNA提取试剂Trizol购自Gibco公司, FuGENE购自Roche公司, NS5ATP13真核表达质粒由本室构建. 表达谱芯片由上海联合基因有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和取材: 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时, 以脂质体转染试剂FuGENE分别将2 μg pcDNA3.1(-)-NS5ATP13和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5×106个细胞加入1 mL Trizol试剂, 立即于液氮中保存.

1.2.2 总RNA提取: 使用Trizol试剂一步法提取NS5ATP13表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A TP13和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28 S、18 S条带变化.

1.2.3 探针标记: 参照Chena et al[25]方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5×SSC+2 g/L SDS杂交液中.

1.2.4 芯片制备: 芯片包含的1 152个cDNA, 由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g /L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线交联, 再分别用2 g/L SDS、双蒸水及2 g/L硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.2.5 预杂交: 将预杂交液放入95 ℃水浴锅内变性2 min, 将待预杂交的芯片放入95 ℃水浴锅内变性30 s, 芯片取出后即放入无水乙醇中30 s, 晾干. 将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内, 盖上盖玻片, 放入杂交箱内42 ℃预杂交5-6 h.

1.2.6 杂交及洗涤: 将探针置于95 ℃水浴中变性2 min; 芯片置于95 ℃水浴中变性30 s, 芯片取出浸于无水乙醇30 s, 探针取出后迅速置于冰上. 将探针置于芯片上, 用盖玻片覆盖, 置于杂交舱中, 用Parafilm密封, 放入42 ℃杂交箱内杂交过夜(16-18 h). 依次以2×SSC+2 g/L SDS、1:1 000 SSC+2 g/L SDS、1:1 000 SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.2.7 扫描与分析: 用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.5, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.4, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果
2.1 总RNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A280>2.01, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h的电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA.

2.2 芯片杂交体系验证及结果分析

在芯片上共有1 152个cDNA. 为了监控芯片杂交体系, 在芯片上设置了阴性对照(8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性. 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异. 按阳性标准, 从1 000个基因中筛选出差异表达基因共86条, 占8.6%, 其中46条基因表达增强, 40条基因表达降低.

2.3 差异表达基因分析

部分表达增强的基因(表1). 部分表达降低的基因(表2).

表1 部分表达显著增加的基因.
编号Cy5/Cy3编码蛋白
12.512酪蛋白激酶1a1(CSNK1A1)
22.516RNA结合基序蛋白6(RBM6)
32.526磷脂酶B1(LYPLA1)
42.568细胞骨架相关蛋白
52.579神经紧张肽(NTS)
62.579翻译抑制蛋白 p14.5(UK114)
72.602转化生长因子βII受体α
82.612氯离子通道/p53调节器官氯离子通道蛋白4(CLIC4)
92.618RB结合蛋白
102.618低密度脂蛋白相关蛋白2(LRP2)
112.620黑素瘤缺乏因子2(AIM2)
122.636乳酸脱氢酶 B
132.656泛素特异性蛋白酶11(USP1)
142.657肿瘤高表达因子(HEC)富含亮氨酸重复序列
152.689调节因子X2, 影响人类组织相容性抗原II表达
162.708cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位β(PRKACB)
172.770选择素2(CUL2)
182.789鲨烯环氧化酶(SQLE), mRNA
192.793Ran结合蛋白2(RanBP2alpha)
202.821凋亡蛋白1抑制因子(MIHC)
212.870DnaJ类热休克蛋白40(HLJ1)
222.904低电压依赖性钙离子通道a1亚单位
232.918alkB分子类似物
242.954转录因子7(TCF7)
252.965甾醇C5脱氢酶(SC5DL),
262.979mRNA亚铁螯合酶
273.021嗜乳脂蛋白亚家族2成员A2(BTN2A2)
283.087钾离子电压门控通道KQT样亚家族成员3
293.110脆性X精神迟滞蛋白1(FMR1)
303.119FYN结合蛋白(FYB-120/130)
313.323包含WD重复序列的SOCS盒
323.457细胞分裂周期蛋白23(CDC23)
333.755造血细胞特异性Lyn底物1(HCLS1)
344.025γ氨基丁酸α受体γ2
354.053FK506结合相关蛋白(FAP48)转录子
365.609cAMP-依赖性蛋白激酶调节亚单位IIβ(PRKAR2B)
表2 部分表达显著降低的基因.
编号Cy5/Cy3编码蛋白
10.243核糖体蛋白L32(RPL32)
20.253突触素样蛋白(SYPL), mRNA
30.274基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)
50.280层粘连蛋白β2 (LAMB2)
60.282谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)
70.282BRCA2和CDKN1A相互作用蛋白(BCCIP)转录本C
80.316转化生长因子β1(TGFB1)
90.322热休克蛋白70(HSPA9B)
100.338小RNA活化复合物, 多肽1
110.352微管相关蛋白, RP/EB 家族成员2(MAPRE2)
120.354CD79A 结合蛋白1(IGBP1),
130.355乙酰辅酶A氧化酶1样蛋白
140.357蛋白磷酸激酶1催化亚单位α型
150.359核仁蛋白
160.364蜡样质脂褐素
170.364钙调素结合蛋白1(CALD1)
180.369金属硫蛋白3(MT3)
190.369假想IL-16蛋白前体
200.370肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚单位3(ARPC3)
210.374层粘连蛋白B受体
220.374有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(MAP3K2)
230.377环指蛋白和肿瘤坏死因子受体相关蛋白
240.383肿瘤坏死因子受体相关蛋白 2(TRAF2)
250.384ADP核糖基转移酶样1(ADPRTL1)
260.390谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)
270.391鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3)
280.392有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(MAP4K3)
290.393亮氨酸拉链
300.394富含半胱氨酸血管生成诱导因子(CYR61)
310.397核糖体蛋白S10
320.400钙联接蛋白(CANX)
3 讨论

丙型肝炎病毒(HCV)感染与肝纤维化及肝细胞癌(HCC)的发生密切相关, 其中病毒基因编码的非结构蛋白NS5A起着重要的作用. HCV NS5A位于HCV多蛋白的羧基末端, 是丝氨酸磷酸化蛋白质, 依磷酸化程度的不同而产生两种不同分子量大小的多肽p56和p58. NS5A是转录反式激活因子, 其羧基末端富含酸性氨基酸及脯氨酸, 这是真核细胞转录因子特有的结构特征. 研究发现[26]NS5A蛋白通过双链RNA-活化蛋白激酶结合域与病毒复制、干扰素抵抗、细胞生长的限制有一定关系, 但是对结合域在疾病发展过程中的作用的认识是很有限的, 有待于进一步研究. 具有易变性特质的NS5A在感染HCV的自然病程中维持稳定, 表明其可能在病毒的生活周期中扮演中心角色. 一般来说, 转录的反式激活因子是在细胞核中起作用的, 而NS5A定位于细胞内质网, 因此推测NS5A可能参与了细胞信号传导途径. NS5A能够反式激活核转录因子NF-κB及STAT3, 在细胞炎症反应、肿瘤发生及转移过程中起重要作用[27]. Ghosh et al[28]研究发现, NS5A蛋白能够抑制细胞周期调节基因p21WAF1, 激活人肝癌细胞中增生细胞核抗原(PCNA)基因, 从而调节细胞凋亡, 促进细胞增生. NS5A cDNA能够使转染的小鼠成纤维细胞NIH 3T3具有转化特性, 且转化细胞移植入裸鼠体内可形成纤维肉瘤灶, 这一证据直接证明了HCV NS5A蛋白的恶性转化潜能.

NS5ATP13是我室利用SSH从分别转染真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A和pcDNA3.1(-)空载体的HepG2细胞中筛选出来的NS5A上调的未知功能蛋白基因, 我们应用基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP13反式调节基因, 发现NS5ATP13可显著影响HepG2细胞基因表达谱, 得到86条显著差异表达基因, 包括已知和未知功能基因, 分别与细胞生长、分化、凋亡等相关.

结果表明NS5ATP13可上调Ran结合蛋白2(RanBP2)、凋亡蛋白1抑制因子(IAP-1, MIHC, cIAP2)、细胞分裂周期蛋白23(CDC23)等. RanBP2作为核孔复合物的组成成分, 在细胞核内外的物质转运中发挥着重要的作用, Forler et al[29]敲除果蝇细胞中的RanBP2, 发现细胞增生和mRNA向核外转运均受到抑制. Gordon et al[30]研究发现IAP-1在恶性胸模间皮瘤细胞中高表达. Lee et al[31]研究发现CDC23通过聚集Dfp1-Hsk1激酶及刺激小染色体维护蛋白的磷酸化参与复制前体复合物的活化过程. NS5ATP13可能通过上调这些凋亡相关因子抑制细胞凋亡, 从而引起肿瘤的发生. cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)可作用于多种与糖脂代谢有关的酶类、一些离子通道和某些转导因子, 使他们发生磷酸化而改变其活性状态. 垂体腺苷酸环化酶激活肽被PKA激活后, 可引起细胞膜的持续去极化, 发挥抗凋亡的效应, 其中, 钾离子通道的活化在程序性细胞死亡中扮演了重要的角色[32]. NS5ATP13通过上调PKA和钾离子电压门控通道KQT样亚家族成员3, 也可能是抑制凋亡发生的机制之一. 同时, 渗透压应激、炎性细胞因子、脂多糖(LPS)、紫外线、生长因子等细胞应激可以激活p38 MAPK信号转导途径, 而有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(MAP3K2)通过p38 MAPK信号转导途径可激活胱冬肽酶-3, 诱导细胞凋亡[33]. MAP3K还可磷酸化IKK(Iκ B kinase). IKK是一种丝/苏氨酸蛋白酶, 活化后可以磷酸化IκB, 进而释放出活化的NF-κB, 使其进入细胞核内发挥转录因子的功能[34]. NS5ATP13下调多种诱导细胞凋亡的信号分子, 可能在肝细胞癌的发生机制中起到一定的作用.

基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)作为胶原酶抑制剂, 抑制Ⅰ型, Ⅱ型, Ⅲ型胶原分解, 在肝纤维化的发生发展过程中起到重要作用[35]. 转化生长因子β1(TGFβ1)可诱导黏附分子CD44, CD49b, CD49, CD51, CD54和CD61以及细胞外基质成分纤维连接蛋白, 层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的表达[36]. NS5ATP13通过下调TIMP1、TGFB1、层粘连蛋白β2(LAMβ2)是否可以抑制肝纤维化的发生和发展, 其作为感染HCV的机体保护机制有待于进一步研究. NS5ATP13除了与已知蛋白基因相互作用外, 尚可作用于一些未知功能基因, 例如可下调假想蛋白AF038182, 其生物学功能以及该假想基因的结构和功能有待于进一步研究.

总之, 利用基因芯片高通量多角度系统地进行基因特征分析, 为我们从一个全新的视角认识靶基因NS5ATP13和HCV非结构蛋白NS5A的分子生物学功能、HCV的致病机制和肝纤维化及肝癌的发病机制打下了重要基础.

编辑:N/A

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