基因表达谱芯片技术筛选HCTP4反式调节基因

摘要

目的: 应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的反式调节基因HCTP4作用的靶基因.

方法: 构建HCTP4基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCTP4, 应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-HCTP4转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞差异表达的mRNA进行检测和分析.

结果: HepG2细胞经转染HCTP4后, 有104条差异基因表达, 其中54条基因表达增强, 50条基因表达降低. 这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.

结论: HCTP4是一种病毒反式激活蛋白, 对于肝细胞基因表达谱有显著影响, 与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关, 在HCV的致病过程中有重要作用.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: July 30, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: November 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)可引起慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌(HCC), 目前有1.7亿人感染, 中国普通人群抗-HCV的阳性率约为3.2%, 干扰素联合利巴韦林是其治疗方案, 但是疗效不佳, 其核心问题之一是有关发病机制不清. HCV core蛋白长191 aa,是一种多功能蛋白质, 除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外, 还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用, 特别是在细胞凋亡中的作用可能与丙肝慢性化及肝细胞癌(HCC)的发生密切. HCV core蛋白具有广泛的反式激活作用, 这种反式激活的作用机制, 一方面是HCV core蛋白本身可以与感染的靶细胞的基因组中相关启动子序列结合, 影响基因表达. 另外一种机制就是HCV core蛋白与感染靶细胞核中转录因子蛋白进行结合, 从而对于靶细胞基因的表达产生间接的影响.

肝炎病毒蛋白与宿主蛋白相互作用, 可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因. 为了从不同的角度对HCV core的反式调节基因进行验证及研究, 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)和分子克隆方法对HCV core反式调节的靶基因HCTP4成功地进行了筛选和克隆[1]. 为更加广泛深入地研究HCV core的反式调节基因HCTP4, 我们应用基因表达谱芯片技术对HCTP4反式调节的靶基因进行筛选鉴定研究, 试图对HCTP4的生物学功能有所了解, 探索丙肝慢性化及肝细胞癌发生的机制.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); Lipofectamine PLUS转染试剂(Gibco), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega).

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体及细胞转染:HCTP4蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-HCTP4为本室构建并保存. 用Lipofectamine PLUS转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)-HCTP4及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞, 48 h后收获细胞.

1.2.2 细胞mRNA提取: 使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了HCTP4表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性定量分析.

1.2.3 探针标记: 常规方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5×SSC+2 g/L SDS杂交液中.

1.2.4 芯片制备: 芯片包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用0.2 g/L SDS、水及0.2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.2.5 预杂交: 将预杂交液放入95 ℃水浴锅内变性2 min, 将待预杂交的芯片放入95 ℃水浴锅内变性30 s, 芯片取出后即放入无水乙醇中30 s, 晾干. 将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内, 盖上盖玻片, 放入杂交箱内42 ℃预杂交5-6 h.

1.2.6 杂交及洗涤: 将探针置于95 ℃水浴中变性2 min; 芯片置于95 ℃水浴中变性30 s, 芯片取出浸无水乙醇30 s, 探针取出后迅速置于冰上. 将探针置于芯片上, 用盖玻片覆盖, 置于杂交舱中, 用Parafilm密封, 放入42 ℃杂交箱内杂交过夜(16-18 h). 依次以2×SSC+2 g/L SDS、1 g/L×SSC+2 g/L SDS、1 g/L×SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.2.7 扫描与分析: 用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene 3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果

2.1 HCTP4蛋白的表达载体构建

HCTP4蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-HCTP4由本室构建.

2.2 总RNA及mRNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A280>1.89, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.

2.3 HCTP4蛋白上调基因类型

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在2.000以上, 就判断为HCTP4蛋白的上调基因. 我们在研究中发现有54种基因的表达水平上调(表1).

表1 HCTP4蛋白部分上调基因类型.

编号	Cy3/Cy5比值	基因名称
1	2.000	苹果酸盐脱氢酶1(MDH1)
2	2.011	磷酸二酯酶2A(PDE2A)
3	2.014	转录变异体1(FAP48)
4	2.017	雌激素调节蛋白LIV-1
5	2.017	DKFZp564L2416克隆
6	2.030	亲脂素亚家族3成员A2
7	2.033	4跨膜位点亚家族A1(MS4A1)
8	2.048	脑丙氨酸脱羧酶(GAD1)
9	2.055	核糖体蛋白L34(RPL34)
10	2.058	锌指蛋白217(ZNF217)
11	2.068	酯酶D
12	2.079	博莱霉素水解酶(BLMH)
13	2.088	溶血磷脂酶(LYPLA1)
14	2.089	KIAA0035基因
15	2.091	RPB5介导蛋白(RMP)
16	2.096	cAMP反应元素结合蛋白CRE-BPa
17	2.118	Ran结合蛋白2
18	2.123	墨角藻糖基转移酶8(FUT8)
19	2.126	转录抑制蛋白(UK114)
20	2.138	热休克蛋白8(HSP8)
21	2.152	KIAA0205基因产物(KIAA0205)
22	2.156	异质核核糖核蛋白K
23	2.174	γ-氨基丁酸A受体γ2(GABRG2)
24	2.174	三十碳六烯环氧化物酶(SQLE)
25	2.183	泛素连接酶E2D3(UBE2D3)
26	2.211	T细胞白血病易位变异基因(TCTA)
27	2.256	热休克蛋白(HSP105B)
28	2.281	凋亡蛋白1抑制因子(MIHC)
29	2.281	CGI107
30	2.285	酪蛋白激酶1(CSNK1)
31	2.303	热休克蛋白(HSJ2)
32	2.325	细胞内氯化物通道4(CLIC4)
33	2.344	KIAA0824蛋白
34	2.370	细胞骨架相关的维生素A反应(JVVA)
35	2.378	KIAA基因产物(KIAA0009)
36	2.395	T细胞受体重排β链基因V区
37	2.396	核受体亚家族3, C组, 成员1(NR3C1)
38	2.403	BCRA2区的假想蛋白
39	2.411	假想蛋白FLJ20432
40	2.414	cAMP依赖性蛋白激酶II(PRKAR2B)
41	2.445	Ig超家族蛋白(Z39IG)
42	2.460	B细胞淋巴瘤10(BCL10)
43	2.498	焦磷酸酶(无机的)(PP)
44	2.525	cAMP分解依赖的蛋白激酶β(PRKACB)
45	2.559	confilin 同功型1
46	2.621	选择素2(CUL2)
47	2.635	肠促胰酶肽型A受体基因
48	2.658	热休克蛋白40
49	2.676	C5固醇脱氢酶
50	2.690	假想蛋白9535
51	2.694	转化生长因子-β
52	2.697	染色体分离子1类(CSE1L)
53	2.730	假想蛋白FLJ11806
54	2.802	肌小管素相关蛋白6

2.4 HCTP4蛋白下调基因

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为HCTP4蛋白的下调基因. 我们在研究中发现有50种基因的表达水平下调(表2).

表2 HCTP4蛋白部分下调基因类型.

编号	Cy3/Cy5比值	基因名称
1	0.040	白细胞转录延长因子2(EEF2)
2	0.188	支架黏附因子B(SAFB)
3	0.214	肌动蛋白结合LIM蛋白1(ABLIM)
4	0.234	KIAA0100基因产物(KIAA0100)
5	0.259	MAP激酶激活死亡域(MADD)
6	0.266	prosaposin(PSAP)
7	0.304	小染色体持续缺陷子3(MCM3)
8	0.313	DEAD/H盒多肽21(DDX21)
9	0.317	DNA, ATP依赖性连接酶Ⅲ(LIG3)
10	0.338	碱化素(BSG)
11	0.343	多聚酶II多肽E(POLR2E)
12	0.347	金属蛋白酶1(MP1)
13	0.348	小EDRK富集因子2(SERF2)
14	0.368	ras同源基因家族成员C(ARHC)
15	0.369	胰岛素受体(INSR)
16	0.373	硫氧化还原素还原酶(TXNRD1)
17	0.375	组织蛋白酶E(CTSE)
18	0.390	丝分裂素激活蛋白激酶激酶激酶2(MAP3K2)
19	0.396	尤因瘤破坏点区1(EWSR1)
20	0.397	RAD23A
21	0.404	N-myc下游调节基因2(NDRG2)
22	0.406	肿瘤坏死因子受体超家族成员5(TNFRSF5)
23	0.414	蛋白磷酸酶2调节亚型A
24	0.415	N-酰基-肽水解酶(APEH)
25	0.415	v-raf鼠胸腺瘤3 611病毒癌基因类同子1(ARAF1)
26	0.416	组织特有的移植抗原P35B(TSTA3)
27	0.416	G蛋白途径抑制子1(GPS1)
28	0.420	1, 25-二羟基维他命D-3(VDUP1)
29	0.420	肌肉丙酮酸激酶(PKM2)
30	0.426	类组织相容性13
31	0.431	蛋白磷酸酶1(PPP1)
32	0.444	CD47抗原
33	0.450	v-akt鼠胸腺瘤病毒基因类同子1(AKT1)
34	0.453	妊娠特有β1糖蛋白6(PSG6)
35	0.454	干扰素调节因子2(IRF2)
36	0.458	肌动蛋白
37	0.466	通过死亡域协助TNFRSF1A(TRADD)
38	0.469	粒素(GRN)
39	0.471	TAL1中断点(SIL)
40	0.471	果蝇属激酶(PLK)
41	0.475	转移生长因子β1(TGFB1)
42	0.478	精氨基琥珀酸盐合成酶(ASS)
43	0.479	KIAA0943蛋白
44	0.481	多核巨细胞克隆15351
45	0.481	CGI-78蛋白
46	0.490	丝氨酸蛋白激酶抑制子
47	0.493	谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX3)
48	0.495	转羟乙醛酶(TKT)
49	0.498	NY-REN-62抗原
50	0.498	烯醇化酶3

3 讨论

与宿主多种形式蛋白相互作用, 可能是HCV感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因. HCV core蛋白转基因小鼠发生HCC病理学特征直接证明了HCV core蛋白的这种作用[2-4]. 因此, 研究HCV core蛋白结合蛋白对于HCV感染慢性化的机制, 以及探讨HCV感染治疗新方法的研究, 具有十分重要的意义. 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)和分子克隆方法对HCV core反式调节的靶基因HCTP4成功地进行了筛选和克隆. HCTP4作为获得新的编码基因序列, 关于其生物学功能, 甚至其医学意义的研究, 有待进一步研究.

我们应用酵母双杂交系统-3筛选出与HCTP4相互作用的蛋白基因11种, 其中免疫球蛋白λ轻链、智能弹(mind bomb, MIB)、小核糖核蛋白G、UMP-CMP激酶与免疫调节、信号转导及能量供给等作用相关, 说明HCV core的反式调节基因HCTP4具有相关作用, 证明HCTP4与core蛋白在HCV感染致病机制作用密切相关[5]. 应用SSH技术筛选到新基因HCTP4与诱导膜损伤的癌前受体、肿瘤排斥抗原(TRA)、肝细胞癌抗原、Fn、干扰素调节因子2结合蛋白、干扰素γ有相互作用, 而这些基因与免疫及肿瘤发生有关, 推测HCTP4在Core蛋白与这些基因之间起桥梁作用.

基因芯片技术是研究基因表达谱改变的有效分析技术[6-8]. 实验中我们用基因芯片技术分析HCTP4, 结果表明, 54种基因的表达水平上调, 50种基因的表达水平下调. 在上调基因中, 细胞内氯化物通道4介导纤维母细胞与肌成纤维细胞间的转化, 与肝纤维化发生有关[9]. 锌指蛋白217增高与肿瘤发生有关[10]. 凋亡蛋白1抑制因子与细胞凋亡关系密切[11]. 细胞骨架相关的维生素A反应调节细胞分化[12]. cAMP是一种重要的信号分子, 对各种细胞功能有重要作用, cAMP通过使不同靶蛋白磷酸化而转导信号, 但cAMP发挥作用须通过激活cAMP依赖的蛋白激酶, 所以cAMP依赖的蛋白激酶与信号转导及细胞功能关系密切[13-14].

在下调基因中, 转移生长因子β1(TGFB1)与控制增生、分化有关, 调节细胞生长的抑制作用, 其信号传导途径发生障碍可引起肿瘤发生[15]. 肌动蛋白结合LIM蛋白1(ABLIM)在调节进化方面有重要作用, 是肿瘤抑制基因之一[16]. HCTP4使TGFB1和ABLIM表达降低, 与HCV感染肿瘤发生密切相关. 鞘糖脂激活因子蛋白由单基因prosaposin编码, 在蛋白分解过程中编码四种不同的鞘脂激活因子蛋白, prosaposin(PSAP)或鞘脂激活因子蛋白缺乏时导致各种鞘糖脂储存疾病[17-18]. 胰岛素是一种多效性激素, 通过与胰岛素受体结合参与多种代谢和有丝分裂[19]. HCTP4使PSAP和胰岛素受体表达减低, 与HCV引起糖、脂肪代谢异常有关[20-21]. DNA, ATP依赖性连接酶Ⅲ与DNA修复、重组有关, 在DNA损伤因子引起的细胞凋亡过程中由钙激活蛋白酶降解[22]. 硫氧化还原素还原酶(TXNRD1)是一种氧化还原蛋白, 参与细胞增生、转化、凋亡. CD47抗原广泛分布在各种组织, 在膜运输和信号转导中有重要作用[23-24]. DEAD/H盒多肽21(DDX21)与细胞生长、分裂有关, 在核糖体RNA的编辑、运输、转录过程中有重要作用[25]. MAP激酶激活死亡域(MADD)与细胞凋亡有关[26]. N-myc下游调节基因2属于alpha/beta水解酶超家族, 是一种胞质蛋白, 与肿瘤发生有关[27]. 肿瘤坏死因子受体超家族成员5(TNFRSF5)介导多种免疫和炎症反应, 包括T细胞依赖性免疫球蛋白的转换、记忆性B细胞发育和生发中心的形成[28-29].

总之, 我们的研究结果表明, 与HCTP4相互作用的基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导、免疫调节、肿瘤发生等. 进一步证明了HCTP4确在HCV的发病过程中有重要作用. 其中HCV与多种基因如转移生长因子β1、肌动蛋白结合LIM蛋白1等有相互作用为首次发现, 这为HCV的致病机制提供了新线索, 有待进一步深入研究.

备注

编辑:N/A

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